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蜱是一类以吸血为生的节肢动物,是人和动物的许多病原的传播媒介,包括细菌、真菌、病毒、立克次体、螺旋体和寄生原虫等多种病原。在中国,已记录的蜱类近120种,其中10余种具有明显的医学重要性,了解病原在蜱体的传播机制,特别是病原体与蜱的相互作用关系,对于蜱和蜱传病的防治具有重要价值。抗微生物多肽作为蜱的先天性免疫效应分子之一,是研究蜱与病原体的相互作用的重要切入点。本实验以镰形扇头蜱吸血前后雄蜱唾液腺的抑制消减杂交cDNA文库中的EST数据为基础,从镰形扇头蜱体内克隆出M200和M50二个新基因。M200基因全长542bp,编码100个氨基酸,预测分子量为9.85kDa,含有典型的信号肽序列,经同源性比较,该基因编码蛋白与与微小牛蜱抗微生物多肽分子Ixodidin序列的显著同源。M50基因全长410bp,编码100个氨基酸,预测分子量为9.0kDa,含有典型的信号肽序列,无显著性同源分子,仅与单一异尖线虫蛋白酶抑制因子有低度同源。结构上,M200和M50预测蛋白都含有半胱氨酸的抗微生物多肽的典型特征,即在C-末端含有6个保守的半胱氨酸残基(C…CXXXC…C…CXC),形成一个称为CSαβ(cysteine-stabilizedαβ)稳定的基序(motif)。综合同源性、结构特征、分子量、信号肽等生物信息学分析结果,初步预测M200和M50为二个编码镰形扇头蜱抗微生物多肽的新基因。应用RT-PCR方法分析了M200和M50基因在蜱的不同组织器官和不同发育阶段的表达情况。结果表明,这二个基因的表达没有组织特异性;M200在蜱的各个发育阶段卵、幼蜱、若蜱和成蜱均有表达,但M50在蜱的卵、若蜱阶段没有表达。应用RT-PCR方法分析了M200和M50基因在蜱的吸血前后的表达模式。M200和M50基因在蜱吸血后的转录量显著高于未吸血蜱,说明这两个基因的表达与吸血有关。成功构建了重组表达载体pGEX-4T-1/M200和pGEX-4T-1/M50,并转化到表达菌BL21中,经IPTG诱导,结果表明M200和M50可以在原核表达系统中高效表达,应用GST融合蛋白纯化系统,可获得纯化的目的蛋白。综上所述,本研究首次克隆、表达了镰形扇头蜱二个新基因,生物信息学分析表明它们可能是二个编码镰形扇头蜱抗微生物多肽。研究结果,为进一步研究这二个分子的生物学功能打下基础。