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背景： 雄激素受体(AR)的共调节因子既有共激活因子能增强AR对靶基因的转录调控能力，也有共抑制因子降低AR的转录激活能力。尽管目前已发现很多的AR共调节因子，比如P160家族的，雄激素受体激活因子类(ARAs)和热休克蛋白类（HSP90、HSP70等），但是多数已发现的AR相互作用蛋白在AIPC和ADPC细胞中的表达差异未明确，并且尚有众多的AR共调节因子未被发现，加之多数已发现的AR共调节蛋白是利用酵母双杂交技术筛选的，酵母双杂交与细胞内蛋白间天然相互作用是有差别的。 目的： 本文旨在:一方面利用免疫共沉淀结合质谱技术筛选和初步鉴定AR的共调节因子，另一方面研究这些共调节因子在前列腺癌细胞株中的功能及比较雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌细胞株中的表达差异。 方法： 1.观察雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌细胞AR核转位规律 将雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP，雄激素非依赖性前列腺癌细胞LNCaP-AI和LNCaP-AI+F细胞分别传代培养，在传代后的24h将每株细胞分两组，一组加入10nmol/L的DHT，一组加等量的无水乙醇，然后于加药后的第0、24、48、72h分别收集细胞，待每株细胞的7个样本全部收集后，再统一做AR的免疫荧光染色和WB，荧光显微镜下观察AR在细胞中的分布情况，或收集细胞后分别提取胞质胞核蛋白，蛋白定量后用Western-blot验证三株细胞的AR在胞质胞核的分布情况，观察AR的核转位规律。 2.AR相互作用蛋白的分离 根据三株细胞核转位的规律，选择合适的时间点收集细胞，即LNCaP细胞在加DHT后72h、LNCaP-AI和LNCaP-AI+F细胞在加DHT后48h，以相应时间点加等量无水乙醇的细胞为对照组收集细胞，然后分别提取各组细胞的胞质胞核蛋白，蛋白定量后按蛋白:抗体为500∶1加入特异性的AR抗体做免疫共沉淀，ProteinA分离抗原抗体复合物，不同浓度的高盐洗液洗去非特异结合产物，PH2.4的甘氨酸缓冲液洗脱抗原抗体复合物，PH8.8的Tis-cl中和洗脱物PH值即得到AR和AR相互作用蛋白复合物。 3.质谱鉴定AR-pull-down蛋白 将AR抗体做免疫共沉淀所得产物（AR pull-down产物）进行SDS-PAGE电泳分离蛋白混合物，再用胰酶进行胶内酶解，酶解后洗涤肽段，最后质谱上机进行LC-MS/MS检测，得到质谱峰后先把原始质谱文件转换为质谱峰文件，再搜索匹配数据库中的序列，并对搜索结果过滤和质量控制，最后得到蛋白的可信鉴定结果。并且根据蛋白鉴定结果，作GO，COG，Pathway功能注释分析。根据质谱结果结合文献查阅和蛋白相互作用网站预测筛选出AR候选共调节因子。 4.免疫共沉淀联合Western-blot验证候选蛋白MYH9是否为AR相互作用蛋白 同前述用AR抗体做CO-IP，AR和MYH9的抗体做WB，正向验证MYH9是否为AR的相互作用蛋白;用MYH9抗体做CO-IP，AR和MYH9抗体做WB反向验证MYH9是否为AR的相互作用蛋白。 5.观察MYH9在不同前列腺癌细胞株中的表达情况 提取前列腺癌细胞株LNCaP、LNCaP-AI和LNCaP-AI+F及LNCaP-AI细胞AR shRNA慢病毒干扰细胞株LNCaP-AI+I四株细胞的总RNA，做QRT-PCR了解四株细胞中MYH9 mRNA的表达水平及是否受DHT刺激。通过细胞爬片-AR和MYH9特异抗体及DAPI做免疫荧光和核质分离做蛋白免疫印记观察MYH9和AR在细胞内的分布和定位情况，是否具有共定位。 6.研究MYH9对AR核转位和转录活性的调节 用不同浓度的MYH9特异性抑制剂Blebbistatin抑制MYH9的活性后，免疫荧光观察对LNCaP、LNCaP-AI和LNCaP-AI+F三株细胞AR核转位的影响和QRT-PCR观察AR靶基因PSA的表达情况，从而研究MYH9对AR转录活性的调节情况。 结果： 1.ADPC和AIPC细胞中AR发生核转位的时间、量和对DHT的依赖性不同 雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP细胞在加DHT48h后AR的核转位比无DHT刺激组增加，对DHT具有明显的依赖性;雄激素非依赖性前列腺癌细胞LNCaP-AI细胞在加DHT24h后AR核转位明显高于对照组，对DHT敏感但是不依赖。雄激素非依赖性前列腺癌细胞LNCaP-AI+F对DHT敏感性差，加DHT组和未加DHT组均在24h后AR核转位增加，但是增加的幅度小，即AR入核的量少。 2.AIPC细胞中筛选到27个已知AR共调节因子和46个候选AR共调节因子 利用蛋白免疫共沉淀联合LC-MS/MS在AIPC细胞LNCaP-AI和LNCaP-F中共筛选到27个已知AR共调节因子，它们有AR共激活因子:HSP90、HSP70、HSPD1、CDC37、HMGB1、HMGB2、HMGA1、ACTB、TRIM21、UBE2N、SUB1、AP1B1、HNRNPK、PARK7、SNW1、CDC42、TAF15、PRMT1、SELENBP1、RBM14、RANP1和THRAP3共22个;AR共抑制因子:HSP27、Calreticulin、FLNA、SAFB和GNB2L1共5个。AR候选共调节因子46个，它们是:HSPA8、HSPE1、HSPH1、HMGB3、HMGN1 P38、FILIP1、FLNB、CTNNA1、CTNND1、TPM1、MYH9、 USP14、USP5、DNAJC8、DNAJC7、DNAJA1、DNAJC3、SNORA63、HNRNPH1、HNRNPCL1、HNRNPU、RBMX、HNRNPD、ANXA2、ANXA5、LOC646214、C1orf116、 CTSD、 PDIA3、CKB、TIPRL、APEX1、TRIM28、STRBP、S100A7、 S100A8、 S100A9、 STIP1、ILF2、ZNF346、ZNF148、ZNF618、RANBP2、LYAR、TGM3和PRMT5。同时免疫共沉淀结合SDS-PAGE分离-考马斯亮蓝染色-质谱鉴定胶条共筛选到8个高丰度的蛋白，它们是:MYH9、HSP9081、HSP70、LYAR、ACTB、APEX1、磷酸丙糖异构酶和HMGB1。 3.免疫共沉淀-蛋白免疫印记鉴定MYH9为AR相互作用蛋白 通过正向免疫共沉淀-蛋白免疫印记结果，可知MYH9明显出现在AR抗体pull-down蛋白中，反向免疫共沉淀-蛋白免疫印记的结果显示，AR微弱地出现在MYH9抗体pull-down产物中，说明MYH9为AR的相互作用蛋白。 4.MYH9在雄激素非依赖性前列腺癌LNCaP-AI胞核内低表达，干扰AR后，MYH9在核内表达升高。 QRT-PCR结果显示MYH9的mRNA在LNCaP和LNCaP-AI+F前列腺癌细胞中表达无统计学差异，但是在DHT刺激组的LNCaP-AI细胞和AR干扰的LNCaP-AI+I中表达下调。在LNCaP-AI细胞中MYH9主要集中在细胞质内，细胞核内分布少，但是相比LNCaP-AI细胞，在LNCaP-AI+I细胞中MYH9在细胞核内的分布却明显增加了。 5.适当抑制MYH9的功能促进了AR的核转位和PSA的表达 不同浓度的Blebbistatin抑制MYH9的功能后，AR核转位的量和PSA的mRNA表达量随抑制剂的浓度升高而增加，20μmol/L时达高峰，40μmol/L时可能由于细胞骨架被破坏，AR核转位和PSA的表达明显下降。 结论： 1.ADPC和AIPC细胞中AR发生核转位的时间、量和对DHT的依赖性不同。 2.在雄激素非依赖性前列腺癌细胞中初步筛选出27个已知的AR共调节因子和46个AR候选共调节因子。 3.MYH9在雄激素非依赖性前列腺癌LNCaP-AI胞核内低表达，干扰AR后，MYH9在核内表达升高。 4.MYH9为一个新的AR相互作用蛋白且抑制AR的核转位和靶基因PSA的表达。