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目的:白癜风是一种获得性色素脱失性疾病,特点为皮肤和/或粘膜中的黑色素细胞功能丧失,有研究表明过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激是白癜风发生和进展的关键因素。氧化损伤在白癜风中的致病作用主要表现为氧化与抗氧化途径失衡、核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件（Nrf2-ARE）通路的激活受损、细胞膜脂质过氧化、过氧化氢酶（CAT）及超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶活性降低。芍药苷（PF）是一种单萜苷类化合物,是白芍总苷的主要活性成分,可以作为抗氧化剂通过激活Nrf2/HO-1通路促进黑色素的合成。黑素细胞分布于表皮的基底层,通过树突向其邻近的角质形成细胞转运黑素,而黑素细胞胞体大小、树突长短及数量的多少等细胞骨架结构的变化与肌动蛋白和微管结构的重排有关。RhoA及其下游的Rho相关蛋白激酶1（ROCK1）可以调控肌动蛋白骨架结构,由于新黑素细胞树突的形成需要肌动蛋白的聚合,所以F-actin也参与黑素细胞骨架结构的调节。抗氧化反应元件（ARE）介导的二期抗氧化酶可对抗氧化应激引起的细胞损伤,转录因子Nrf2在此过程中起着关键作用。氧化应激时Nrf2可以从Kelch样ECH联合蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein1,Keap1）解离,并转位到细胞核中,上调抗氧化应激基因的表达,其中包括NADPH醌氧化还原酶（NQO1）和HO-1。Nrf2表达降低可以导致白癜风患者黑素细胞抗氧化损伤能力下降。所以Nrf2的表达上调可能对白癜风的治疗有帮助。然而,芍药苷或白芍总苷能否降低白癜风患者黑素细胞的氧化损伤尚未见报道。在本研究中,探索了芍药苷对过氧化氢诱导的黑素细胞氧化损伤的作用及作用机制。研究方法:本研究的实验对象为永生化正常人黑素细胞系（PIG1）及永生化白癜风黑素细胞系（PIG3V）,芍药苷粉末配置方法为将25mg的芍药苷粉末溶于250μl的DMSO溶液中,配置成浓度为200μM的溶液,于-80℃深低温冰箱冻存,用254培养基稀释到需要浓度后进行后续实验。使用MTS法测不同浓度芍药苷（50μM、100μM、200μM、400μM）对黑素细胞细胞增殖和细胞活性的作用。使用流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡情况,而氧化应激标志物活性氧水平也使用流式细胞术进行检测。WST-8法测定超氧化物歧化酶（SOD）含量,过氧化氢酶（CAT）含量使用过氧化氢酶检测试剂盒测定。氧化应激相关基因mRNA表达情况筛选使用PCR array人氧化应激试剂盒进行,差异基因蛋白质表达水平使用Western Blot技术进行检测;细胞黑素小体含量及分布情况及细胞骨架结构F-actin使用免疫荧光染色法进行检测。骨架相关蛋白RhoA、ROCK1及Nrf2信号通路相关蛋白表达情况使用Western Blot技术进行检测。同时使用siRNA进行基因敲除实验,使用sp600125试剂进行JNK基因抑制实验。数据分析及图表绘制使用GraphPad Prism 7.0版软件,使用单因素方差分析进行多组比较。数据表示为至少三个独立实验的均数±标准差。P值<0.05认为差异具有统计学意义。本研究其余图片使用Photoshop 7.0软件进行拼接。结果:PIG1中芍药苷浓度为50μM及100μM时均促进细胞增殖,然而当药物浓度升高为200μM或400μM时细胞增殖受到抑制。PIG3V中药物浓度为50μM、100μM、200μM、400μM时均促进细胞增殖。最终选择芍药苷浓度50μM进行后续实验。MTS细胞活性检测结果表明芍药苷预处理24h不能改善H2O2处理后的细胞活性降低。然而芍药苷预处理48h可以明显改善氧化损伤细胞的细胞活性（P<0.05）。总之,细胞增殖及细胞活性结果表明芍药苷浓度为50μM,预处理非24h时而是48h时可减少H2O2诱导的氧化损伤,增加细胞活性。H2O2 1.0mM给药处理24h后,PIG1和PIG3V细胞出现明显的G2/M期细胞周期阻滞,PIG1细胞G2/M期所占比例约从5%增加到27%,PIG3V细胞G2/M期所占比例约由16%增加到44%。芍药苷预处理24h后,PIG1及PIG3V应激细胞的细胞周期G2/M期均增加（P<0.05）,而48h时其没有增加,细胞周期结果表明,芍药苷调节应激细胞G2/M期的细胞周期过程。经1.0 mM H2O2处理24h后,与空白对照组相比较,PIG1和PIG3V细胞的凋亡细胞平均百分比增加到35%左右。然而芍药苷预处理24h可以抑制两种黑素细胞应激损伤时的凋亡率（P<0.05）,但芍药苷预处理48h不能减少H2O2诱导氧化损伤的黑素细胞的凋亡细胞数。细胞凋亡结果表明芍药苷可以改善H2O2诱导的黑素细胞的氧化损伤。用芍药苷预处理PIG1或PIG3V细胞24h,然后用H2O2处理黑色素细胞24h,检测与氧化应激相关的标志物,过氧化氢处理24h后,氧化应激特异性标志物活性氧水平与细胞组相比明显增加（P<0.05）,而芍药苷预处理24h可显著降低活性氧水平（P<0.05）。在H2O2组处理的PIG1、PIG3V细胞中,抗氧化酶SOD、CAT的活性显著降低,而芍药苷预处理24h可显著升高SOD、CAT水平（P<0.05）。因此,芍药苷能够明显增强黑色素细胞的抗氧化能力。PCR array结果表明芍药苷加过氧化氢组与单纯过氧化氢组相比,在PIG1细胞中MB表达上调2.61倍,PTGR1基因表达下调2.38倍,PIG3V细胞中PDLIM1表达下调3.64倍,Western blot实验结果表明PF+H2O2组与H2O2组比较,MB基因在PIG1细胞中表达上调,在PIG3V细胞中表达未见明显差异。PTGR1基因在PIG1细胞中表达上调,PIG3V细胞中表达下调。PIG1细胞中PDLIM1基因在蛋白水平表达上调,PIG3V中表达下调。由于PDLIM1基因参与细胞骨架组成调控,所以进行Western实验进一步检测芍药苷是否影响相关骨架蛋白的表达。芍药苷预处理24h后继续给予过氧化氢1.0mM处理24h。研究结果表明PIG1细胞中芍药苷预处理24h可使H2O2诱导的骨架蛋白RhoA、ROCK及F-actin表达上调,而PIG3V中使ROCK1蛋白表达下调。PDLIM1基因敲除相关实验结果表明氧化应激条件下PIG1细胞中芍药苷通过PDLIM1抑制RhoA及其下游基因ROCK1的表达,PIG3V细胞中PDLIM1抑制ROCK1的表达。敲除ROCK不能调控PDLIM1的表达,但可以调控F-actin蛋白的表达。免疫荧光结果提示黑素细胞中H2O2诱导的氧化损伤组细胞所含黑素小体数量及骨架蛋白F-actin含量减少,芍药苷预处理24h可以抑制H2O2诱导的黑素小体减少及细胞树突缩短。PIG1及PIG3V细胞中芍药苷均抑制H2O2诱导的JNK/Nrf2/HO-1表达的降低。PIG1细胞中JNK正向调控Nrf2的表达,然而PIG3V细胞中JNK抑制Nrf2的表达。进一步结果表明JNK基因抑制后PIG1、PIG3V细胞中PDLIM1基因表达上调。PDLIM1基因敲除后PIG1、PIG3V细胞中Nrf2基因表达上调,表明JNK/Nrf2/HO-1信号通路与PDLIM1/RhoA/ROCK1途径相互作用以保护黑素细胞免受氧化损伤。结论:1)芍药苷浓度为50μM预处理24h对PIG1、PIG3V细胞活性有促进作用,H2O2诱导的氧化损伤导致细胞周期阻滞在G2/M期,芍药苷作用于细胞周期的G2/M期且对H2O2诱导的黑素细胞凋亡起抑制作用。芍药苷对H2O2诱导的PIG1及PIG3V活性氧水平升高起抑制作用,增加抗氧化物酶SOD、CAT水平。2)PF+H2O2组与H2O2组比较PIG1细胞中MB、PTGR1、PDLIM1蛋白水平表达上调;PIG3V细胞中MB基因蛋白水平表达未见明显变化、PTGR1及PDLIM1蛋白水平表达下调。3)PIG1细胞中芍药苷预处理24h可使H2O2诱导的骨架蛋白RhoA、ROCK及F-actin表达上调,而PIG3V中使ROCK1、F-actin蛋白表达下调。氧化应激条件下PIG1细胞中芍药苷通过PDLIM1抑制RhoA/ROCK1的表达,PIG3V细胞中PDLIM1抑制ROCK1的表达,ROCK1不能调控PDLIM1基因的表达,但正向调控F-actin蛋白的表达。免疫荧光结果表明芍药苷抑制H2O2诱导的黑素小体的减少及树突缩短。本研究表明芍药苷可激活JNK/Nrf2/HO-1信号通路并且与PDLIM1/RhoA/ROCK1途径相互作用以保护黑素细胞免受氧化损伤。