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尽管重症医学已取得很大发展,但脓毒性休克,脓毒症合并器官功能不全的死亡率仍然很高。大量研究表明,脓毒症是一种具有整体特征性且不断发展变化的、极其复杂的临床综合症,其牵涉因素众多且相互影响,相互促进。传统的单线性研究并不能从根本上解决问题,只有弄清参与脓毒症发生发展成分的相互作用,从相互作用网络中寻找关键环节,可能有助于我们改善脓毒症的治疗。研究表明血管内皮在脓毒症这场交响乐中扮演着非常重要的角色。血管内皮是脓毒症发生、发展过程中LPS、细胞因子、炎症介质、黏附分子、自由基等主要靶标,与脓毒症发展过程中白细胞附壁黏着、附壁滚动、跨壁游出,微血栓形成,血管反应性降低,血管通透性增加等关系密切。而且血管内皮具有异质性,是血源性信号的监测者和转导者,其通过感知和整合血流和血液成分的物理和化学环境的变化信号,作出相应的反应。那么,在脓毒症发展过程中,作为最易受损的器官—肺脏,其血管表面分子存在什么样的异质性,其血管表面的特征性分子与脓毒症临床表型的变化是否具有密切的关系,这些差异血管表面分子具有什么样的功能,是否具有潜在的诊断与治疗价值。为了回答上述问题,我们采用体内噬菌体展示肽库技术结合生物信息学高通量分析从“血管蛋白质组学的角度”,即在蛋白与蛋白相互作用水平基础上绘制内毒素休克状态下肺脏血管的特异性功能图谱。本研究腹腔注射LPS 35 mg/Kg作用6h使平均动脉血压低于40 mmHg,建立内毒素休克BALB/c小鼠模型,尾静脉注射M13噬菌体环七肽库到内毒素休克小鼠体内,回收与内毒素休克小鼠肺血管结合的噬菌体,扩增纯化后,重复筛选共4轮后,采用正常小鼠进行体内差减。实验结果显示,内毒素休克小鼠肺血管结合的噬菌体明显富集,四轮筛选后,自肺组织回收噬菌体的量较第一轮高出8.13倍,而肝脏、脑血管结合的噬菌体,随筛选轮次的增加而减少。正常小鼠体内差减后,噬菌体回收率在1%左右。四轮筛选差减后,送测序92个噬菌体PCR产物,结果显示,编码展示肽部分内的氨基酸密码子符合NNK（N=Gor A or T or C;K=G or T）形式的环七肽92条,其中非冗余环七肽22条,CSAWSNKFC为32条,占第四轮送测序环七肽的35.16%。为证实展示CSAWSNKFC环七肽噬菌体特异性靶向内毒素休克肺,尾静脉注射展示CSAWSNKFC噬菌体,经配伍方差分析,内毒素休克小鼠不同脏器血管结合CSAWSNKFC噬菌体的量存在显著差异（F值为96.027,P值＜0.001＜0.05）。内毒素休克小鼠肺血管结合展示CSAWSNKFC噬菌体的量分别是肝脏6.62倍,肾脏4.99倍,心脏16.6倍,脑10.48倍。此外,经析因方差分析,噬菌体展示的不同序列显著影响肺血管结合噬菌体（F值为193.063,P值＜0.001＜0.05）,内毒素休克小鼠肺血管结合展示CSAWSNKFC噬菌体的量是结合对照噬菌体量的23倍。而且,内毒素休克状态显著影响小鼠结合噬菌体（F值为76.580,P值＜0.001＜0.05）,内毒素休克小鼠肺血管结合展示CSAWSNKFC噬菌体的量是正常小鼠肺血管结合量的3.8倍。经抗M13噬菌体抗体免疫组化分析,尾静脉注射展示CSAWSNKFC噬菌体,内毒素休克小鼠肺泡毛细血管显示强的染色,内毒素休克小鼠肝脏、脑、肾脏、心脏血管显色不明显。同时正常小鼠肺血管显色也较内毒素休克小鼠肺血管显色弱。尾静脉注射对照噬菌体,内毒素休克小鼠肺血管未见明显显色。为进一步证实M13噬菌体展示的CSAWSNKFC环七肽特异性靶向内毒素休克小鼠肺血管,我们构建了His-EGFP-CSAWSNKFC融合蛋白进行竞争性抑制实验。尾静脉注射1,000μg His-EGFP和展示CSAWSNKFC噬菌体没有显著影响内毒素休克小鼠肺血管结合展示CSAWSNKFC噬菌体的量（t值为1.401,P值为0.22＞0.05）。而尾静脉注射His-EGFP-CSAWSNKFC和等量展示CSAWSNKFC噬菌体,内毒素休克小鼠肺血管结合展示CSAWSNKFC噬菌体的量随着His-EGFP-CSAWSNKFC剂量的增加而减少,经单因素方差分析,F值为7.642,P值为0.022＜0.05,具有显著统计学意义。尾静脉注射1,000μgHis-EGFP-CSAWSNKFC时与尾静脉注射1,000μg His-EGFP比较可显著抑制内毒素休克小鼠肺血管结合展示CSAWSNKFC噬菌体的量（P值为0.008＜0.05）。为识别内毒素休克状态下与CSAWSNKFC环七肽相互作用的肺血管表面受体,我们采用His-EGFP融合蛋白沉降技术、荧光差异双向电泳技术结合质谱,鉴定与CSAWSNKFC环七肽相互作用的膜受体。首先,通过差速离心结合蔗糖密度梯度离心提取和纯化正常小鼠和内毒素休克小鼠肺脏细胞质膜,2%OG裂解肺脏质膜,免疫印记检测肺脏质膜蛋白中细胞质膜上的特异蛋白—Caveolin-1,证实质膜得到明显富集。接着,用His-EGFP、His-EGFP-CSAWSNKFC融合蛋白分别沉降内毒素休克小鼠肺脏质膜蛋白,用His-EGFP-CSAWSNKFC融合蛋白沉降正常小鼠肺脏质膜蛋白,洗脱液（7M尿素、2M硫脲、4%CHAPS）洗脱蛋白,Cy2标记His-EGFP与内毒素休克小鼠肺脏质膜蛋白结合的样品,Cy3标记His-EGFP-CSAWSNKFC与正常小鼠肺脏质膜蛋白结合的样品,Cy5标记His-EGFP-CSAWSNKFC与内毒素休克小鼠肺脏质膜蛋白结合的样品,所有样品混合,荧光差异双向电泳,建立差异蛋白图谱。Cy5与Cy2比较,出现六处新的蛋白点,而且,Cy5与Cy3比较该六处蛋白点的荧光强度增强1.5倍以上。差异点经质谱鉴定且蛋白评分为100%的分别为ATP酶β亚单位（ATP synthase subunitβ）,葡萄糖调节蛋白-78（78 kDaglucose-regulated protein）,β-肌动蛋白（β-actin）,醛脱氢酶（aldehydedehydrogenase）。免疫印记检测肺脏质膜中ATP酶β亚单位的表达,内毒素休克小鼠肺质膜中的表达量较正常小鼠肺质膜多,与荧光差异双向电泳结果一致。由于本课题是想从血管组学的角度结合生物信息学进行高通量分析,初步绘制内毒素休克小鼠肺血管特异性功能性图谱,为了获得大批量非冗余内毒素休克小鼠肺血管结合肽,经不同轮次差减后小批量的测序结果分析,从经济角度考虑同时也为了尽量减少非特异结合的噬菌体,我们最终选用二轮筛选差减后的噬菌体进行大规模测序,经测序编码展示肽部分内的氨基酸密码子符合NNK（N=G or A or T or C;K=G or T）形式的七肽共1375条。CD-HIT软件对1,375个七肽进行去冗余分析,获得808个非冗余七肽,从正、反两个方向将这些七肽连续分割成为一系列只含有3个氨基酸的三肽基序,每个七肽可以分割成为5个不同的三肽基序,总共获得8,080个三肽,以完全重排七肽的处理方法,并根据泊松分布的原理计算P值,以P≤2.5×10-5的三肽作为有显著性意义的三肽,分析之后,得到具有显著性的三肽152条。应用Clustal W软件并结合氨基酸性质,分别对包含具有显著性意义的三肽基序的所有七肽进行多序列比对分析,分析之后共得到具有代表性的特征性短肽基序48条。获得的特征性短肽基序可能是与内毒素休克小鼠肺血管内皮表面分子结合的配体（血液中的分泌蛋白或血液细胞的表面分子）序列的一部分,即这些短肽基序可能是内毒素休克小鼠肺血管内皮表面分子配体的功能性模拟表位。特征性短肽基序BLAST分析后得到的鼠源性蛋白,经分泌蛋白预测、跨膜蛋白预测,ExPASy蛋白质数据库、NCBI数据库以及相关文献综合分析,特征性短肽基序可能模拟的功能蛋白（血液中的分泌蛋白或血液细胞的表面受体）共137种,这些特征性短肽当中,有一些不同的特征性短肽与同一蛋白的不同结构域相匹配,而有一些特征性短肽与不同蛋白的同一结构域相匹配。这些蛋白参与的生物学过程有炎症反应、免疫反应、细胞黏附、血液凝血与抗凝血、细胞的增殖与凋亡、血管的舒缩、能量代谢、血管的通透性等。通过研究,我们得出以下结论:1.内毒素休克小鼠肺血管表面分子存在异质性。2.CSAWSNKFC环七肽特异性靶向内毒素休克小鼠肺血管。3.CSAWSNKFC环七肽可能与内毒素休克小鼠肺血管表面的ATP酶β亚单位,葡萄糖调节蛋白-78,β-肌动蛋白,醛脱氢酶相互作用,为近一步研究CSAWSNKFC环七肽在内毒素休克肺损伤中血管靶向性治疗提供了重要线索。4.内毒素休克小鼠肺质膜ATP酶β亚单位表达量增加。5.获得48条与内毒素休克小鼠肺血管结合的特征性短肽。6.48条特征性短肽可能模拟137种肺血管内皮表面分子的配体,初步绘制了内毒素休克小鼠肺血管特异性功能性图谱。137种功能性配体参与的生物学过程有炎症反应、细胞黏附、免疫反应、血液凝血与抗凝血、细胞的增殖与凋亡、血管的舒缩、能量代谢、血管的通透性等。为近一步探索内毒素休克肺损伤的发病机制,寻找更好的预测指标和干预靶点提供了重要的参考信息和线索。