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目的:胰腺癌恶性度高,发病率逐年上升。据报道,80%的胰腺癌患者由于转移的发生失去手术机会。Wnt/β-catenin通路在消化道肿瘤进展中具有重要作用。此外,肿瘤转移的趋向性学说以及趋化因子受体CXCR4的作用备受关注。据此,设计该实验,旨在1.明确Wnt/β-catenin经典通路在胰腺癌细胞中的活性,以及Wnt/β-catenin通路靶基因在胰腺癌细胞中的表达;2.观察Wnt拮抗剂DKK-1和sFRPs因子在胰腺癌中的表达,探讨Wnt拮抗剂表遗传学改变对胰腺癌Wnt/β-catenin通路的作用机制;3.观察胰腺癌组织中CXCR4的表达变化以及与临床病理特征之间的关系;4.观察胰腺癌组织中β-catenin的表达变化,探讨其与CXCR4的相互关系;5.利用RNAi技术构建CXCR4 shRNA表达载体,观察Wnt/β-catenin通路活性及靶基因的变化,验证CXCR4调控Wnt/β-catenin通路抑制胰腺癌的假设;6.观察CXCR4基因干扰后胰腺癌细胞增殖、细胞周期以及侵袭能力的变化。方法:1.通过PGL3-OT/OF荧光素酶检测方法观察Wnt/β-catenin通路在胰腺癌细胞中的活性,应用Real-time PCR技术检测Wnt通路下游靶基因及Wnt拮抗剂DKK-1和sFRPs mRNA水平的表达,观察Wnt/β-catenin经典通路在胰腺癌细胞中的变化;2.通过MSP方法和5-氮杂-脱氧胞苷酸处理分析Wnt拮抗剂sFRPs、DKK-1在胰腺癌细胞中的甲基化,并应用基因重组技术双向调节DKK-1在不同胰腺癌细胞中的表达,观察Wnt通路活性的变化,分析Wnt拮抗剂的甲基化对Wnt通路的调节作用;3.通过免疫组化分析CXCR4、β-catenin在胰腺癌组织中的表达,以及与临床病理特征之间的关系,探讨CXCR4与β-catenin的相关性;4.通过RNAi技术构建CXCR4 shRNA表达载体,转染胰腺癌CXCR4高表达细胞,通过Realtime-PCR、Western Blot实验观察RNAi对CXCR4基因的抑制效率;5.通过PGL3-OT/OF荧光素酶检测方法观察CXCR4基因沉默后对胰腺癌Wnt/β-catenin经典通路活性的影响,并通过Realtime-PCR、Western Blot实验观察CXCR4 shRNA对Wnt/β-catenin通路下游靶基因以及侵袭转移相关蛋白的影响;6.通过MTT实验、流式细胞术、软琼脂克隆形成实验检测CXCR4基因干扰后胰腺癌细胞增殖、细胞周期以及细胞成瘤性的变化,并应用Transwell侵袭小室观察CXCR4干扰对胰腺癌细胞侵袭转移力的影响。结果:1.与正常胰腺细胞相比,多数胰腺癌细胞表现为Wnt/β-catenin通路的异常激活,此外,Wnt/β-catenin下游靶基因的mRNA水平也具有不同程度的升高,通过对β-catenin Exon 3的测序分析,未发现胰腺癌具有β-catenin Exon 3的突变;2. Wnt拮抗剂sFRPs和DKK-1因子在胰腺癌细胞中表达水平较低,MSP分析发现sFRPs和DKK-1启动子区在胰腺癌细胞中发生甲基化,5-氮杂-脱氧胞苷酸处理后能显著提高DKK-1和sFRP-1的表达(P<0.01)。当RNAi技术干扰DKK-1表达后,Wnt通路活性上升;当PCMV-XL5-DKK1转染细胞上调DKK-1表达时,Wnt通路活性下降(P<0.05);3. CXCR4与β-catenin在胰腺癌组织中具有异常表达,两者之间有显著相关性(rs=0.443, P=0.002)。此外,CXCR4表达高的胰腺癌患者临床预后差;4.特异性CXCR4基因沉默能够在基因和蛋白水平稳定、高效、特异地抑制CXCR4的表达,抑制效率达70%以上,同时,磷酸化CXCR4蛋白表达水平也有明显的下降(P<0.05);5.特异性CXCR4干扰后能够显著抑制PGL3-OT转染后的荧光素活性(P<0.05)以及Wnt/β-catenin靶基因的表达;6.特异性CXCR4 shRNA能够抑制细胞生长,细胞达到对数生长期的时间延长(P<0.05),同时CXCR4基因沉默能够阻滞Miapaca-2细胞于G0/G1期,减少S期细胞的数目,抑制细胞的增殖能力。同时,软琼脂克隆形成实验发现CXCR4干扰后,细胞克隆数目显著减少(P<0.01)。Transwell实验证明CXCR4基因干扰后细胞侵袭能力减低(P<0.05),即使SDF-1的刺激也不能够使细胞侵袭能力增加。结论:1.胰腺癌细胞中存在Wnt/β-catenin通路的异常激活。Wnt通路的激活与β-catenin Exon 3的突变无关;2.胰腺癌中Wnt拮抗剂发生表遗传学变化,启动子区的甲基化引起DKK-1表达沉默可能是胰腺癌Wnt通路异常激活的原因,DKK-1的表达与胰腺癌Wnt经典通路的活性呈负相关;3. CXCR4在胰腺癌中异常表达,与β-catenin表达显著相关,CXCR4表达高的胰腺癌患者临床预后差;4. CXCR4基因沉默能抑制Wnt/β-catenin经典通路在胰腺癌中的活性,阻遏Wnt/β-catenin通路下游靶基因表达,抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭和成瘤能力。