论文部分内容阅读
目的本实验旨在研究活化性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin receptor, KIR) KIR2DS1是否可介导自然杀伤(natural killer,NK)细胞活化,进而发挥杀伤活性；检测表达KIR2DS1基因的NK细胞对携带不同HLA-Cw抗原的白血病细胞杀伤作用的差异,以初步了解KIR/配体与NK细胞毒活性的相关性,为临床上异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantion, allo-HSCT)选择合适的供者以增强移植后移植物抗白血病(graft versus leukemia, GVL)效应提供依据。方法1、PCR-SSP法和PCR-SBT法分别检测KIR基因和HLA-Cw基因：采用聚合酶链式反应和序列特异性引物(Polymerase chain reaction and sequence specific primer, PCR-SSP)基因分型法检测符合实验条件的健康志愿者的KIR基因；采用聚合酶链式反应-直接测序分型法(Polymerase chain reaction and sequence based typing, PCR-SBT)检测符合实验条件的健康供者和AML患者的HLA-Cw基因。2、根据KIR和HLA-Cw基因的检测结果进行分组：(1)根据HLA-Cw甚因进行分组。将健康供者及AML患者分别分为C1纯合子组、C2纯合子组和C1/C2杂合子组。(2)根据是否表达KIR2DS1基因进行分组。将健康供者NK细胞分为KIR2DS1阳性组和KIR2DS1阴性组。3、分选NK细胞：采集20ml符合实验条件的健康志愿者的外周血。采用RosetteSep(?)人NK细胞负选试剂盒分选NK细胞。流式细胞仪检测分选前后细胞纯度变化情况。4、NK细胞培养：分选后的NK细胞进行体外培养,实验组为培养体系中加入细胞因子(IL-2+IL-15)组合,对照组为培养体系中未加任何细胞因子。倒置显微镜进行观察细胞形态。全自动细胞计数仪计数细胞,检测培养前后的NK细胞数量的变化情况。5、采集白血病细胞：选择符合实验条件的10例初治的急性髓细胞白血病(acute myelogeneous leukemia, AML)患者。采集新鲜骨髓液5ml,淋巴细胞分离液以分离获得单个核细胞(mononuclear cells, MNC:经流式细胞仪检测白血病细胞比例>90.0%),将其作为靶细胞。6、封闭KIR2DS1基因：采用抗-KIR2DS1抗体以封闭KIR2DS1基因,检测封闭前后NK细胞杀伤活性的差异。7、NK细胞毒作用检测：采用CCK-8(cell counting kit-8)比色法,效靶比为10：1条件下,在不同培养时间下,检测NK细胞对K562细胞的杀伤率。在效靶比5:1、10:1、20：1条件下,以实验组扩增培养的NK细胞作为效应细胞,白血病细胞作为靶细胞,检测NK细胞对白血病细胞的杀伤作用差异。结果1、NK细胞通过负选试剂盒分选富集后,经流式细胞仪检测,测得分选后CD3-CD56+细胞比例为(91.2±5.94)%,较分选前显著增高。2、纯化的NK细胞在体外培养扩增14天,实验组扩增倍数为44.37±3.69,显著高于空白对照组(3.63±2.71)(p<0.05)。3、10例初治AML患者的新鲜骨髓液经淋巴细胞分离液分离单个核细胞后,经流式细胞仪检测,测得白血病细胞比例均大于90%。4、加入刺激因子IL-2和IL-15的NK细胞培养组,与对照组(未加入上述刺激因子)比较,刺激因子组NK细胞对K562细胞的杀伤率明显高于未加刺激因子组NK细胞对K562细胞的杀伤率,差异有统计学意义p<0.05)。5、效靶比分别为5:1、10:1、20：1时,表达KIR2DS1受体的NK细胞加入封闭抗体后,杀伤率(27.24±4.29)%、(33.85±7.64)%、(35.32±5.78)%分别较封闭前(33.79±5.49)%、(42.82±6.81)%、(45.96±8.24)%明显减低,差异有统计学意义(p<0.05)。6、效靶比为5：1时,IL2+IL15组NK细胞对K562细胞的杀伤率(64.37±5.02)%较未加细胞因子组NK细胞对K562细胞的杀伤率(24.53±4.38)%明显增高,差异有统计学意义(p<0.05)；效靶比分别为5:1、10:1、20：1时,KIR2DS1阳性NK细胞对靶细胞的杀伤率(33.79±5.49)%、(42.82±6.81)%、(45.96±8.24)%分别高于KIR2DS1阴性NK细胞对白血病细胞的杀伤率(17.55±4.96)%、(28.61±5.14)%、(30.53±6.52)%,差异有统计学意义(p<0.05)。效靶比为10：1时,C1纯合子组KIR2DS1阳性NK细胞对C2纯合子组白血病细胞的杀伤率(54.39±3.46)%明显高于对C1纯合子组(41.22±3.68)%和C1／C2杂合子组白血病细胞(41.32±5.09)%的杀伤率,差异有统计学意义p<0.05)。结论1、活化性KIR2DS1受体可激活NK细胞,使其发挥异源反应性,杀伤白血病细胞,增强移植后GVL效应。2、表达HLA-C1分子的KIR2DS1阳性NK细胞对表达HLA-C2分子的白血病细胞的杀伤作用强,选择合适的KIR/HLA-Cw供者有利于受者移植后GVL效应的增强。