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蛋白O-GlcNAc修饰参与了细胞内众多的基础生命活动过程,由于缺乏合适的研究手段,其确切的生物学功能鲜有报道。人们认为O-GlcNAc修饰理想的研究手段是应用O-GlcNAc修饰位点特异的抗体,但是目前尚没有商品化的O-GlcNAc修饰位点特异的抗体,严重阻碍了蛋白O-GlcNAc修饰生物功能的研究。
Akt是P13K/Akt信号通路中的一个关键信号分子,其生物功能的异常活化是一个几乎在所有肿瘤中都存在的病理现象,尽管已报道肿瘤中的Akt分子同时存在磷酸化修饰和O-GlcNAc修饰,但是AktO-GlcNAc修饰位点尚未确定,AktO-GlcNAc修饰与其磷酸化修饰的相互作用关系也不清楚。
本文以Akt为研究对象,以阐述AktO-GlcNAc修饰与其磷酸化相互作用关系为研究目的,开发了一个不依赖于O-GlcNAc位点特异的抗体,而是使用O-GlcNAc修饰泛抗体,通过比较总目标蛋白和O-GlcNAc修饰目标蛋白的磷酸化比例,直接确定蛋白O-GlcNAc修饰与其磷酸化相互作用关系的实验方法,已经部分达到O-GlcNAc修饰位点特异抗体的效果。
应用该实验方法,本文评价了两种类型的AktO-GlcNAc修饰对其磷酸化的影响,即PUGNAc处理的MCF-7细胞中的AktO-GlcNAc修饰和MCF-7细胞中组成型表达的AktO-GlcNAc修饰对其磷酸化的影响。结果表明,MCF-7细胞中存在少量具有抑制效应的AktO-GlcNAc修饰,组成型表达的AktO-GlcNAc修饰对Akt308Thr和473Ser磷酸化展现了一定的抑制效果:而PUGNAc处理可显著增加MCF-7细胞中具有抑制效应的AktO-GlcNAc修饰,PUGNAc诱导的AktO-GlcNAc修饰对Akt308Thr和473Ser磷酸化展现了显著的抑制效果。该实验结果提示,在AktO-GlcNAc修饰与其磷酸化之间存在一个动态的、复杂的相互作用关系。
为了验证以上实验结果,同时也是为了对该方法进行佐证,我们进一步采用质谱技术,通过严格的数据分析,尤其是通过SequenceTag手工分析技术进行确证,发现在Akt308Thr附近区域存在O-GlcNAc修饰位点,推测由于空间位阻,会影响308Thr磷酸化,减弱Akt激酶活性。该实验结果直接验证了本文开发的实验方法的有效性,同时也表明本文实验方法可以作为一个研究手段,评价基于O-GlcNAc修饰预测的蛋白O-GlcNAc修饰生物功能。
综上,本文建立了一个能够直接检测蛋白O-GlcNAc修饰与其磷酸化相互作用关系的实验方法,该方法应用已有的试剂和实验技术,能够在大部分细胞生物学实验室开展,将会成为研究蛋白O-GlcNAc修饰对其磷酸化影响的一个有力的实验工具。利用该方法,本文首次报道了PUGNAc诱导的AktO-GlcNAc修饰能够显著抑制其308Thr和473Ser磷酸化,揭示在AktO-GlcNAc修饰和其磷酸化之间存在着一个动态的、复杂的相互作用关系,上述实验数据为深入阐述AktO-GlcNAc修饰在糖尿病和肿瘤中的作用提供了新的线索与依据。