论文部分内容阅读
目的: 利用体内、体外实验观察黄芪甲昔对阿尔茨海默症小鼠神经干细胞微环境对神经干细胞的增殖、分化的影响及其基于Notch通路的作用机制研究。 方法: (1)分离培养小鼠原代神经干细胞与星形胶质细胞，显微镜下观察细胞的形态，免疫荧光染色鉴定神经干细胞及星形胶质细胞;CCK8法检测不同浓度黄芪甲苷对原代神经干细胞活性的影响;利用Transwell建立细胞共培养模型，免疫荧光分析神经干细胞分化细胞类型;Western blot检测Jagged1、Notch1、Hes1与VEGF蛋白表达。 (2)给予阿尔茨海默症模型APP/PS1小鼠腹腔注射黄芪甲苷;Morris水迷宫检测小鼠学习和记忆能力，免疫荧光观察小鼠脑组织神经干细胞增殖及分化，Western blot测定Jagged1、Notch1、Hes1与VEGF蛋白表达。 结果: 1.体外实验 (1)黄芪甲苷中剂量与低剂量对体外神经干细胞单独培养具有促增殖作用，能够提高克隆形成率(p＜0.05），而高剂量促增殖作用不明显。中剂量黄芪甲苷在与胶质细胞和内皮细胞同胶质细胞共培养环境中能够促进神经干细胞增殖。诱导分化5天后，进行GFAP/β-tubulin-Ⅲ免疫荧光双标染色。观察发现神经干细胞与内皮细胞共培养组较神经干细胞组比较呈大量分化状态，GFAP与β-tubulin-Ⅲ标记的阳性细胞比例显著增多(p＜0.001)。黄芪甲苷作用后，GFAP阳性细胞比例显著减少，而β-tubulin-Ⅲ阳性细胞比例明显增高（p＜0.01)。观察胶质细胞与神经干细胞共培养组，神经干细胞仍以克隆球的状态生长，GFAP与β-tubulin-Ⅲ阳性细胞较NSCs组明显增加（p＜0.01)。黄芪甲苷刺激后，与对照组比较阳性神经元数目明显增加，但GFAP阳性细胞比例略有下降(p＜0.05)。内皮细胞同胶质细胞与神经干细胞共培养组的克隆球大量趋向GFAP阳性细胞分化，β-tubulin-Ⅲ阳性细胞分化率较低。给予黄芪甲苷后，可见克隆球周边大量分化为β-Tubulin-Ⅲ阳性细胞，神经元分化率显著提高(p＜0.05)，同时GFAP阳性细胞所占细胞分化比例较对照组有明显减少(p＜0.05)，具有统计学意义。 (2) Western blot测定Notch通路相关蛋白及VEGF表达:神经干细胞与内皮细胞共培养组与神经干细胞组比较，Jagged1与Hes1水平下降(p＜0.05），VEGF水平升高(p＜0.05)，具有统计学意义。黄芪甲苷作用后，Notch1与Hes1表达增高（p＜0.05）。神经干细胞与胶质细胞共培养组与神经干细胞组比较，Jagged1明显下降(p＜0.05）。黄芪甲苷刺激后，Notch1，Hes1与VEGF表达较用药前明显升高(p＜0.05)。神经干细胞与内皮和胶质细胞共培养组同神经干细胞组比较，VEGF，Hes1与Notch1表达水平升高(p＜0.05)。黄芪甲苷作用后，Jagged1较对照组降低(p＜0.05)，而Notch1、Hes1表达升高(p＜0.05)。 2.体内试验 (1)给予APP/PS1小鼠腹腔注射黄芪甲苷4周后，黄芪甲苷高剂量组与黄芪甲苷低剂量组均能改善小鼠空间学习与记忆能力，但不同剂量组之间差异不显著。黄芪甲苷对APP/PS1脑内神经干细胞增殖分化具有促进作用，用药各组小鼠的β-tubulin-Ⅲ阳性细胞数量与模型组相比均显著增多(p＜0.05)，高剂量与低剂量组比较无显著性差异;模型组GFAP阳性细胞数目显著高于用药各组，用药组之间及正常组与用药组比较GFAP阳性细胞数没有显著差异，但与模型组比较，均有统计学意义(p＜0.05）。 (2) Western blot测定Notch通路相关蛋白及VEGF表达:黄芪甲苷低剂量组与模型组比较，Jagged1，Notch1表达升高，且Hes1水平较模型组明显上调(p＜0.05)。黄芪甲苷高剂量组较模型组Jagged1水平显著升高(p＜0.01)，Notch1表达亦上调，而Hes1表达水平无明显变化，同时用药各组VEGF表达水平明显高于模型组(p＜0.05)。 结论: (1)体外实验采用Transwell小室实现星形胶质细胞、内皮细胞和NSCs三者共培养，成功构建NSCs在脑内的微环境，更接近于NSCs的在Niche内的生存结构状态。中剂量黄芪甲苷能够促进体外神经干细胞的增殖，提高克隆形成率，同时在共培养诱导的分化过程中，显著提高β-tubulin-Ⅲ阳性细胞分化比例。 (2)体内实验表明黄芪甲苷能够明显改善AD模型小鼠的空间学习与记忆能力，增加齿状回区域β-tubulin-Ⅲ阳性细胞数目，一定程度上降低GFAP细胞的异常增多。 (3)无论体外还是体内实验均表明，黄芪甲苷的作用是通过介导神经干细胞微环境的Notch通路，调控相关蛋白Notch1，Jagged1，Hes1以及VEGF的表达，参与NSCs的增殖和分化过程，并最终影响β-tubulin-Ⅲ阳性细胞的产生。