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遗传药理学(pharmacogenetics)是研究由遗传变异引起的药物反应异常的学科,主要集中研究引起药物反应个体和群体差异的变异基因。药物基因组学(pharmacogenomics)是个体遗传差异与药物效应之间相互关系的学科,研究整个基因组范围内所有编码与药物代谢、体内转运、效应有关的蛋白质的基因,其分子基础是基因多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)。
遗传药理学研究发现,药物代谢酶、受体和转运体活性的改变是导致临床上药物治疗中出现药物反应个体差异常见因为,药物代谢酶、受体和转运体基因的遗传多态性是药物作用个体差异的重要决定因素。许多药物受体表现基因多态性并影响药物的作用,如p受体的多态性改变β受体对激动药的敏感性而影响这类药在哮喘治疗中的作用。受体的多态性可能从改变药物与受体的亲和力、受体的稳定性和受体的调节、与信号传导系统的耦合或与靶基因结合变化及受体之间的相互调节等方面影响个体间药物效应的差异。
β肾上腺素受体(β-adrenoceptor,β—AR)为肾上腺素受体的一个亚家族,属于G蛋白偶联受体超家族,以肾上腺素和去甲肾上腺素为内源性配体,通过调节细胞内cAMP水平,介导多数器官与组织的功能,是药物作用的一个重要靶点,该类受体的表达及功能与疾病的发生发展和药物效应均有潜在的关系。其成员β3-AR,与β1-AR和β2-AR有不同的药理特性,β3-AR主要表达在脂肪组织、心脏、骨骼肌、膀胱和小肠等组织中,尤其以内脏脂肪组织如肾周及网膜最丰富,对机体脂肪代谢的调节和能量平衡的维持有重要作用。β3-AR发挥效应通过与Gs蛋白结合活化相应的PKA(protein kinase A)通路和与Gi蛋白结合激活ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase1 and2)通路。75-80％的脂肪酸水解效应是由PKA介导的,而20-25％通过ERK1/2途径实现。β3肾上腺素受体基因(ADRB3)定位于8p12-p11.2,编码408个氨基酸。β3-AR在人群中呈多态性表达,目前已发现ADRB3基因上四个SNPs,T190C为唯一功能性变异,使受体蛋白第64位色氨酸由精氨酸替代(Trp64Arg)。人群中Arg64等位基因的发生频率具有一定的种族和地区差异,印地安人为31％而美国白人为8％,该多态性可能与体重增加、胰岛素抵抗、2型糖尿病(type2 diabetes mellitus,T2DM)的发生发展及冠心病发病等有关。ADRB3 Trp64Arg多态在T2DM患者中的分布频率高于正常对照组,在多个人群中的研究都发现突变型个体的体重指数显著增高,携带Arg64突变等位基因的肥胖个体比Trp64携带者的减轻体重的能力要弱。有研究表明,Trp64Arg可能影响β3-AR在膜表面的分布及信号传导,从而影响其介导的生理和药理效应。
我们前期的研究工作中发现位于ADRB3基因1号外显子mRNA上493位和769位各有一个T被C替代的碱基突变,导致氨基酸序列中165和257位丝氨酸突变成脯氨酸,记为Ser165Pro和Ser257Pro,这两个新突变为本课题组首次发现,已申请进入GENEBANK(编号:FJ170286和FJ170287)和SNPBANK(编号:rs72655364和rs72655365)。基于ADRB3多态性与T2DM和肥胖相关的研究背景,本课题旨在研究ADRB3基因中三个错义突变Trp64Arg、Ser165Pro和Ser257Pro在中国汉族T2DM、肥胖和对照人群中的分布频率及与T2DM、肥胖疾病易感性的关系；并构建ADRB3野生型和不同突变型的真核表达载体和稳定表达细胞株,为研究人β3-AR的功能及调控机制提供实验基础,同时检测经特异性β3-AR激动剂CL316,243刺激后细胞内cAMP含量和ERK1/2蛋白磷酸化的水平判断野生型和突变型受体对两条信号传导通路的影响,从可能的机制上解释基因多态性与疾病易感性的关系。
T2DM是以胰岛素抵抗和胰岛p细胞功能受损为特征的疾病,遗传度变异较大,全基因组关联分析研究(Genome-wide associationstudies,GWASs)和meta分析发现多个新的T2DM的易感位点,这些区域可能在胰岛素的分泌和胰腺β细胞功能中发挥重要作用。
SLC30A8(zinc transporter member8)基因编码蛋白锌转运体-8(ZnT-8),位于胰岛β细胞中含有胰岛素颗粒的囊泡膜上,是参与胰岛素合成、储存和分泌的重要成分。多项GWASs研究发现,SLC30A8基因rs13266634多态与T2DM的发病风险增加相关。SLC30A8基因SNP rs13266634和rs16889462位于第八个外显子,引起第325位精氨酸至色氨酸(谷氨酰胺)的错义突变(R325W或R325Q)影响胰岛素颗粒中锌的蓄积、胰岛素的稳定、贮存和分泌。胰岛素样生长因子2(IGF2)mRNA结合蛋白2(insulin—like growth factor2 mRNA-binding protein2,IGF2BP2)属于mRNA结合蛋白家族,与RNA的定位、稳定性及翻译等功能有关,IGF2BP2基因的变异与T2DM的进展相关,且IGF2BP2同样能够影响胰岛素的分泌。
瑞格列奈是一种常用于治疗T2DM的安全有效的胰岛素促泌剂,瑞格列奈通过结合磺酰脲类受体,抑制胰岛β细胞上的ATP敏感性钾通道,促进钙离子内流而刺激胰岛素的分泌。瑞格列奈主要在肝脏由CYP3A4和CYP2C8氧化代谢,由OATP1B1转运。瑞格列奈在临床治疗T2DM过程中常出现较大的个体差异,除了可能由于参与代谢和转运的基因变异导致血药浓度的改变而产生的差异外,其他参与胰岛素合成、分泌和释放过程中的基因变异也可能导致瑞格列奈疗效的改变。本实验旨在研究中国汉族人群SLC30A8基因rs13266634、rs16889462多态性和IGF2BP2基因rs1470579和rs4402960多态性的等位基因、基因型频率分布特征及其与代谢相关指标的关系,了解该基因多态性与T2DM的易感相关性及对瑞格列奈疗效的影响。
本课题的主要研究结果如下:
1.ADRB3基因Trp64Arg多态性与中国人T2DM的发病无明显相关性,Ser165Pro和Ser257Pro多态性与T2DM的发病相关。
2.健康对照组中,ADRB3基因Trp64Arg位点多态性与WHR和HbAlc值显著相关。在健康对照组中Ser165Pro位点突变与年龄、TG、TC和FPG值显著相关；在Nonobese T2DM患者中,Ser165Pro位点突变与BMI和FPG值显著相关；在ObeseT2DM患者中,Ser165Pro位点突变与LDL、HbAlc、FPG、腰围、臀围、DBP、总蛋白、白蛋白、PINS和HOMA-β显著相关。在Nonobese T2DM患者中,Ser257Pro位点突变与腰围和WHR显著相关。
3.ADRB3基因Ser165Pro和Ser257Pro基因多态性、年龄等与T2DM显著关联,为危险因素。Ser165Pro基因多态、性别、腰围、臀围、WHR、TG与肥胖显著关联,为危险因素。
4.成功构建了不同基因型的人pcDNA3.1(+)/ADRB3-WT(WildType)、ADRB3-Trp64Arg、ADRB3-Ser165Pro、ADRB3-Ser257Pro和ADRB3一Com Mut真核表达载体和表达不同基因型的
ADRB3稳定转染细胞株HEK293和CHO-K1。
5.表达ADRB3 Trp64Arg、Ser165Pro、Ser257Pro和Com Mut基因型的细胞经β3-AR激动剂CL316,243作用后后产生第二信使cAMP的能力较野生型和空载体组显著下降,对ERK1/2蛋白的磷酸化变化不同基因型细胞株间没有显著差异。
6.SLC30A8基因rs13266634位点的C等位基因和rs16889462位点的A等位基因可能是T2DM的风险等位基因,SLC30A8基因可能是中国汉族T2DM患者的易感基因之一,该基因的多态性影响瑞格列奈的疗效,突变基因型携带者使用瑞格列奈的效果优于野生型携带者。
7.中国人群中IGF2BP2rs1470579和rs4402960与T2DM的发生发展相关并影响瑞格列奈的疗效。
本课题从分子、细胞到临床整体水平对β3-AR基因多态性与T2DM和肥胖的疾病易感相关性提供了遗传药理学的解释,并从药物基因组学的角度探讨了瑞格列奈临床疗效的差异,为T2DM的病因研究及合理用药的机理进行初步探索。遗传学的研究在T2DM的病因学和进展机制的研究中具有重要作用。复杂疾病的遗传学研究为寻找易感基因的证据,并从易感基因着手进行靶基因的功能、信号通路、作用机制及环境-基因和基因-基因相互作用的研究,最终目的为临床早期预测、诊断和治疗提供新契机,并实现个体化治疗。