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目的:紫杉醇(paclitaxel)和顺铂(cisplatin)是治疗非小细胞肺癌(NSCLC)一线化疗药物,也是治疗其他恶性肿瘤的广谱化疗药物。此前研究表明,两种化疗药物均可以通过不同作用机制诱导肺癌细胞凋亡;但最近研究发现,化疗药物激活凋亡通路后,活化的caspase-3可切割Gasdermin家族成员GSDME(Gasdermin E)产生活化形式的N末端片段(GSDME-NT),后者可在细胞膜上发生成孔效应,进而诱导细胞继发性坏死/焦亡。GSDME表达于多种人肺癌细胞,包括A549肺癌细胞。紫杉醇和顺铂是否可通过caspase-3/GSDME诱导A549细胞发生继发性坏死/焦亡目前尚不清楚。因此,本文探究了紫杉醇和顺铂诱导NSCLC细胞株A549细胞继发性坏死/焦亡的作用机制,旨在为有效减轻化疗药物的毒副作用,优化化疗方案提供实验参考数据。方法:(1)WST-1检测紫杉醇和顺铂的细胞毒性,推算出两种药物的IC50(半抑制浓度)。(2)Annexin V/7-AAD染色法、可固定活性染料FVD染色法,碘化丙啶(PI)/Hoechst 33342染色法探究细胞经紫杉醇和顺铂处理后的死亡方式和形态学特征。(3)JC-1试剂盒检测紫杉醇和顺铂对细胞线粒体膜电位的影响。(4)蛋白质免疫印迹法检测紫杉醇和顺铂处理细胞后细胞裂解物中cleaved caspase-3、GSDME-NT、PARP等蛋白的表达水平。(5)使用capspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO预处理细胞,探究是否可抑制紫杉醇和顺铂诱导细胞继发性坏死/焦亡。(6)靶向GSDME的si RNA转染细胞,敲低细胞对GSDME的组成型表达,检测是否可抑制紫杉醇和顺铂诱导细胞继发性坏死/焦亡。结果:(1)药物作用48 h后紫杉醇在溶解度范围内依然无法达到IC50,但顺铂的IC50约为25μM。(2)紫杉醇和顺铂均可以诱导A549细胞凋亡和继发性坏死/焦亡,但顺铂诱导细胞继发性坏死/焦亡的水平要显著高于紫杉醇。相同浓度和时间处理条件下,在形态学上紫杉醇作用后细胞整体变圆,细胞内容物皱缩,细胞膜保持完整性且有质膜起泡现象,但泡的形状较小;顺铂作用后,许多细胞也呈现出皱缩现象,细胞膜完整性丧失,PI阳性细胞(裂解性死亡的细胞)表现出细胞继发性坏死/焦亡的标志性形态学特征,即从细胞膜向外吐大泡现象。紫杉醇在溶解度可达到的高浓度(240μM)下,作用48 h后PI阳性细胞的数量占比显著增高,且出现从细胞膜向外吐大泡现象。(3)紫杉醇可降低A549细胞线粒体膜电位,但顺铂对此并未有显著影响。(4)紫杉醇和顺铂给药后,凋亡起始蛋白caspase-8和-9,凋亡执行蛋白caspase-3和-7,凋亡底物PARP依次被活化;继发性坏死/焦亡标志性蛋白GSDME经紫杉醇和顺铂作用后也被活化切割产生GSDME-NT,活化程度与上游caspase-3的活化水平、细胞继发性坏死/焦亡的水平相一致。相同浓度和时间作用条件下,顺铂诱导细胞活化GSDME的水平要高于紫杉醇的作用。(5)Caspase-3特异性抑制剂(Ac-DEVD-CHO)抑制了顺铂诱导的GSDME-NT的生成和随后的继发性坏死/焦亡水平。(6)靶向敲低GSDME显著抑制了顺铂诱导的细胞继发性坏死/焦亡。结论:紫杉醇和顺铂通过caspase-3介导GSDME诱导A549细胞继发性坏死/焦亡,且顺铂诱导A549细胞发生继发性坏死/焦亡的水平高于紫杉醇,这些结果提示顺铂在治疗高表达GSDME的肺癌时比紫杉醇更具优势。