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背景和目的：Sonic Hedgehog(SHH)分泌信号分子家族在早期胚胎发育、器官分化过程中发挥重要的调控作用,通路的异常激活还与人类肿瘤的发生与演进密切相关。SHH蛋白是由SHH基因编码的一种高度保守的分泌型糖蛋白。上皮型钙粘蛋白(E-cadherin)是一类广泛分布于胚胎和成熟组织上皮组织介导细胞间同质粘附的钙依赖性单次跨膜糖蛋白,是在生理条件下维持组织结构形态的完整性和细胞极性的重要成分。白细胞介素-6(interleukin-6)是细胞因子网络中重要成分之一,亦是一种多功能的细胞因子,通过复杂的细胞信号传导途径,对细胞生长、分化、凋亡、转化及免疫反应等过程都具有重要的调节作用。最近越来越多的研究显示,SHH信号通路的异常激活和过度表达、E-cadherin表达减弱或缺失及IL-6的失调控参与多种肿瘤的发生过程,但SHH信号通路、E-cadherin和IL-6在炎症疾病尤其是结石性胆囊炎组织中的作用在国内尚无报道。本课题拟通过对慢性结石性胆囊炎、胆囊癌组织标本中SHH、E-cadherin和IL-6表达水平的同步观察,探讨慢性结石性胆囊炎向胆囊癌发展转化机制,目的旨在寻找胆囊癌特异性分子标志物,以利早期诊断及特异性靶向治疗。材料和方法：1.胆囊炎标本的收集：选取广州军区武汉总医院2005年1月至2010年12月间经病理确诊、且术后病理蜡块保存完好的慢性结石性胆囊炎患者术后的组织标本120例,其中男性48例,女性72例,平均年龄51.8岁。其中轻度慢性结石性胆囊炎45例,中度慢性结石性胆囊炎45例,重度慢性结石性胆囊炎30例。对照组为囊腺癌患者术后组织标本(36例),男性20例,女性16例,平均年龄61.4岁,手术前均未放疗或化疗。2.常规HE染色判断胆囊炎分级：60℃烤片30min,二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水；磷酸盐缓冲液(PBS)洗5min,共3次；苏木素染色液染色5min；自来水冲洗去多余的染色液,约10min,蒸馏水洗涤；盐酸酒精分化30s；自来水冲洗,浸泡15min；伊红染色液染色30s-2min(根据染色结果和要求调整时间)；梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。慢性结石性胆囊炎分级标准：轻度：病程<1年；B超提示胆囊壁轻度肥厚或无明显的结节状增厚现象；病理检查显示黏膜上皮保持完好.腺上皮细胞无异型性,炎细胞浸润以淋巴细胞为主,有或无罗-阿氏窦下延,有腺体的轻度增生,黏液腺分泌增强。中度：介于轻度和重度之间。重度：病程>5年；B超检查提示有胆囊体积的萎缩或增大,有胆囊壁弥漫性或局限性(结节状)增厚,多伴有息肉样病变；病理检查显示黏膜上皮部分或大部分脱失,未脱失的腺上皮细胞形成代偿性区域性增生集中,增生的腺体有不规则的扩张,腺上皮细胞增生活跃。增厚的胆囊壁组织内形成单个腺管及多个腺管的异型增生灶,炎细胞浸润程度重,淋巴滤泡形成,纤维结缔组织增生,多有罗-阿氏窦下延,黏液腺分泌增强。3.免疫组化法检测组织标本SHH、IL-6和E-cadherin蛋白表达：60℃烤片30mmin,二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水后,对组织抗原进行高温热修复；室温下冷却至常温；磷酸盐缓冲液(PBS)洗5min,共3次,加3%过氧化氢孵育以阻断内源性过氧化物酶活性；磷酸盐缓冲液(PBS)洗2mmin,共3次；滴加非免疫性动物血清阻断非特异性结合,20min后甩去封闭液加一抗4℃保湿,过夜；PBS洗5min,共3次,滴加二抗,室温孵育30min; PBS洗2min,共3次；DAB显色,自来水终止反应并冲洗5min；苏木素复染,清水冲洗；梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。4.病理图像分析定量检测组织标本SHH、IL-6和E-cadherin蛋白含量：切片经免疫组化染色完成后,每张切片随机选取5个不同高倍视野(×400)进行拍照。免疫组织化学染色图像分析检测：在光镜下观察指标：免疫复合物沉积部位及免疫反应强度的观察。阳性判断标准：当细胞膜和(或)胞浆出现棕黄色阳性物质作为阳性细胞。观察参数：慢性结石性胆囊炎和胆囊癌组织中E-cadherin和IL-6表达的阳性颗粒的参数值——平均灰度、阳性单位。图像分析及数据统计分析：在400倍视野下,每张玻片选取5个视野,采用武汉千屏公司HMIAS-2000高清晰度彩色病理图片报告分析系统测定阳性颗粒的平均灰度和阳性单位值。5.统计学分析：运用SPSS13.0软件进行统计学分析。胆囊炎、胆囊癌组织SHH、IL-6、E-cad蛋白表达的阳性单位、平均灰度值以x±s表示,采用单因素方差分析进行了完全随机设计的方差分析(方差齐时采用Fisher法,其中两两比较采用LSD法；方差不齐时采用Welch法,其中两两比较采用Dunnett T3法)及Pearson相关分析,以F为统计量,以双侧a=0.05作为检验水准,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.SHH的表达与各临床病理指标之间的关系：SHH主要在胆囊黏膜上皮细胞和胆囊癌细胞的胞膜上和胞浆内表达。慢性轻、中、重度结石性胆囊炎及对照组(胆囊癌组)组织标本中SHH阳性颗粒的平均灰度和阳性单位值有统计学意义(P<0.01),表现出随慢性结石性胆囊炎由轻到重的不同病理损伤程度而阳性颗粒的平均灰度和阳性单位值呈显著性上升趋势,对照组(胆囊癌组)最高。SHH蛋白表达与性别、年龄等因素均无关(P>0.05),SHH蛋白表达与结石大小(直径>3cm或<3cm)具有统计学意义(P<0.01)。2. E-cadherin的表达与各临床病理指标之间的关系：E-cadherin主要在胆囊黏膜上皮细胞和胆囊癌细胞的胞膜上和胞浆内表达。慢性轻、中、重度结石性胆囊炎及对照组(胆囊癌组)组织标本中E-cadherin阳性颗粒的平均灰度和阳性单位值有统计学意义(P<0.01),表现出随慢性结石性胆囊炎由轻到重的严重程度而阳性颗粒的平均灰度和阳性单位值呈显著性下降趋势,对照组(胆囊癌组)最低。E-cadherin蛋白表达与性别、年龄等因素均无关(P>0.05), E-cadherin蛋白表达与结石大小(直径>3cm或≤3cm)具有统计学意义(P<0.01)。3.IL-6的表达与各临床病理指标之间的关系：IL-6主要在胆囊黏膜上皮下间质、胆囊黏膜上皮细胞胞浆和胆囊癌细胞的胞浆内表达(图4)。慢性轻、中、重度结石性胆囊炎及对照组(胆囊癌组)组织标本中IL-6阳性颗粒的平均灰度和阳性单位值有统计学意义(P<0.01),表现出随慢性结石性胆囊炎由轻到重的不同病理损伤程度而阳性颗粒的平均灰度和阳性单位值呈显著性上升趋势,对照组(胆囊癌组)最高(表1)。IL-6表达与性别、年龄等因素均无关(P>0.05),IL-6表达与结石大小(直径>3cm或＜3cm)具有统计学意义(P<0.01)。4. SHH、E-cadherin和IL-6蛋白在慢性结石性胆囊炎组织中表达的相关性分析：配对资料的Pearson相关分析显示,SHH表达与E-cadherin表达呈负相关关系(r平均灰度=-0.71,r阳性单位=-0.68, P<0.01), SHH表达随E-cadherin表达上升而表现出下降趋势。IL-6表达与E-cadherin表达呈负相关关系(r平均灰度=-0.75,r阳性单位=-0.83,P<0.01),IL-6表达随E-cadherin表达上升而表现出下降趋势。SHH表达与IL-6表达呈正相关关系(r平均灰度=0.71,r阳性单位=0.88,P<0.01),SHH表达随IL-6表达上升亦表现出上升趋势。结论：本实验结果显示SHH、E-cadherin和IL-6表达与慢性结石性胆囊炎病情的严重程度及胆囊结石的大小有关,与病人年龄、性别等因素均无关。研究通过Pearson相关分析发现,SHH和IL-6表达存在正相关关系,SHH、IL-6与E-cadherin表达分别呈负相关关系。我们的结果提示,在慢性结石性胆囊炎组织中,SHH信号通路异常激活可能引起胆囊上皮细胞的过度增殖和恶变,E-cadherin作为一种抑癌基因,其表达下调可能导致胆囊上皮细胞骨架破坏与极性丧失,IL-6的长期表达上调可能引起胆囊上皮细胞的过度增殖,并且三者存在一定相关性。有研究表明,E-cadherin表达下调参与激活SHH信号通路,SHH通路中转录因子Gli1能活化E-cadherin的抑制物Snail,现已明确Snail作为转录抑制因子,可直接与E-cadherin的启动子E-boxes结合,从而抑制E-cadherin转录,导致E-cadherin表达下调进而介导上皮细胞骨架破坏、转移和侵袭能力增强。组织炎症反应过程中,表达上调的IL-6可激活核转录因子KB(NF-KB),而活化的NFKB可进入细胞核内引起转录因子Snail表达上调以介导上皮细胞骨架破坏。因此我们推测,作为诱发慢性胆囊炎最主要原因之一的胆囊结石长期机械损伤导致胆囊黏膜上皮细胞骨架破坏,极性丧失和E-cadherin表达下调,进而通过激活SHH信号通路引起胆囊上皮细胞过度增殖,同时活化的SHH通路通过活化Snail进而抑制E-cadherin的表达。慢性炎症导致细胞因子IL-6过表达,进而诱导胆囊黏膜上皮细胞过度增殖。IL-6亦通过激活NF-KB诱导E-cadherin表达下调,使上皮细胞骨架破坏、极性丧失进一步加重,细胞侵袭力增强,形成恶性循环,最终导致肿瘤的发生。本研究提示,慢性结石性胆囊炎发展过程中长期机械损伤使胆囊上皮细胞骨架破坏、极性丧失,引起IL-6失调控、E-cadherin表达下降或缺失以及SHH信号通路异常高表达,三者协同作用参与胆囊癌的发生发展。这一研究结果为临床胆囊癌的发生学说展示了新视角,也为将来开发胆囊癌的分子靶向治疗开拓了新思路。