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蛋白酶抑制剂(PI，protease inhibitor)在动物、植物、微生物以及人类自身的代谢调控过程中起着非常重要的作用。抑制剂与蛋白酶的协同调节使体内各种生理过程得以有条不紊的进行。由于抑制剂功能的重要性与独特性，越来越多的科研工作者开始将目光转移到抑制剂的研究上。迄今为止，已经有数百种蛋白酶抑制剂相继得到分离和鉴定，并且有多种抑制剂被证明具有治疗肿瘤、人类获得性免疫缺陷症等恶性疾病的潜在应用价值。 植物是各种蛋白酶抑制剂的主要来源。在植物中，丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究最早，认识也最为深入。根据抑制剂之间的序列同源性、活性位点位置以及二硫键数目，人们将植物来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂分为Bowman-Birk，Kunitz，PotatoⅠ，PotatoⅡ，Cucurbit，Cereal, Taumatin-like和Ragi A1等家族。目前的研究主要集中于Bowman-Birk家族、Kunitz家族和PotatoⅠ家族。 荞麦属于药食同源作物，是我国传统的小杂粮作物。作为一种健康食品，荞麦越来越受到人们的青睐。有研究证明，来自荞麦中的蛋白酶抑制剂具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。我们先前的研究通过分子生物学技术获得了一种重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(Recombinant buckwheat trypsin inhibitor，rBTI)，其生物学活性与天然BTI活性相近，研究表明，rBTI属于丝氨酸蛋白酶抑制剂中的PotatoⅠ家族。体外实验显示，rBTI能诱导不同肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无副作用。rBTI作为一种功能性蛋白，对其结构与功能的深入研究具有重要的理论意义及实际价值。 为了揭示rBTI结构与功能的关系，表征rBTI的结构特点，本研究依据序列比对和胰蛋白酶酶解实验结果，利用定点突变方法将rBTI氨基酸序列中第45位Arg进行突变，先后构建了R45A-aBTI和R45F-fBTI两个突变体。抑制活性实验显示，突变体aBTI和fBTI均丧失了对胰蛋白酶的抑制活性，从而确定了rBTI的活性位点为Arg45。对突变体的抑制活性鉴定我们发现，aBTI和fBTI虽然失去了对胰蛋白酶的抑制作用，却分别显示出对弹性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制活性。理化性质分析表明，野生型抑制剂rBTI和两个突变型抑制剂具有较好的热稳定性和酸碱稳定性。MTT比色法以及细胞核形态学观察结果显示，突变体aBTI和fBTI在体外仍然能有效抑制HL-60和EC9706肿瘤细胞的增殖，并且具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。 本研究采用定点突变技术和理化性质分析，不仅确定了rBTI的活性位点，而且获得了两种新型蛋白酶抑制剂aBTI和fBTI。体外功能鉴定表明，rBTI活性位点的改变并不影响其对肿瘤细胞的生长抑制作用。这为进一步研究蛋白酶抑制剂结构与功能的关系以及抗肿瘤药物的研制提供了新的思路。