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抗肿瘤免疫治疗即利用患者自身免疫系统识别清除肿瘤细胞，近几年在抗肿瘤治疗过程中展现出巨大的临床治疗潜能。相比于传统治疗方式，免疫治疗不仅对原发性肿瘤具有抑制作用，同时还可以对抗肿瘤转移，抑制肿瘤复发，因此免疫治疗是极具潜力的一种肿瘤治疗方式。随着恶性肿瘤的不断发展，肿瘤会通过多种机制抵抗免疫治疗，如何实现有效的个体化免疫治疗是抗肿瘤免疫治疗亟待解决的一个问题。本研究在纳米科技层面上，针对免疫治疗过程中出现的问题，设计了两个系统：1.以纳米Fe3O4为转运载体实现肿瘤内源性抗原淋巴结靶向转运，增强肿瘤个体化免疫治疗；2.构建具有免疫佐剂性质的阳离子纳米粒P2PMs，增强基于肿瘤细胞抗肿瘤疫苗的治疗作用。具体内容如下：
1.基于纳米Fe3O4实现肿瘤内源性抗原淋巴结靶向转运以增强肿瘤个体化免疫治疗研究
目前，大多数抗肿瘤免疫治疗依靠外源性抗原输入以获得抗肿瘤免疫应答，但肿瘤作为高突变性疾病，常常会导致一个或多个抗原缺失，患者之间抗原无法共享，因此，使用固定的一个或多个抗原很难对肿瘤进行个体化免疫治疗。利用患者自身抗原是实现个体化免疫治疗最直接有效的途径，但肿瘤组织内免疫抑制微环境的存在，使在肿瘤组织中直接呈递抗原将很难产生有效的免疫应答。基于此，本课题希望通过纳米载体，将肿瘤内源性抗原转运至淋巴器官，以增强个体化免疫治疗。得益于小粒径纳米粒子（＜50nm）可自由通过淋巴管到达淋巴结，本课题选择了生物相容性较好的纳米Fe3O4（≈10nm）为潜在的纳米转运载体，以将肿瘤组织内的抗原转运至淋巴结中。实验结果证明选择的Fe3O4纳米粒不仅具有较强的蛋白吸附效率，且能够有效靶向至淋巴结，可以作为一种潜在的淋巴结靶向转运载体。
为确保Fe3O4纳米粒在肿瘤组织内具有最佳的蛋白结合效率，本课题将脂质体作为Fe3O4纳米粒保护层，同时在磷脂双分子层内部负载声敏剂Ce6（Ce6/Fe3O4-L），以实现纳米Fe3O4在肿瘤组织超声响应性释放。通过实验证实，Fe3O4纳米粒被成功包载在脂质体内核中，在超声作用下，Ce6/Fe3O4-L可大量产生活性氧（ROS）。这些ROS不仅可以诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡（ICD），同时促使Fe3O4释放。同时证实，释放的Fe3O4纳米粒仍具有较强的蛋白吸附作用，且吸附的蛋白中含有大量的肿瘤相关性抗原。
小鼠体内分布实验证实，超声作用后，Ce6/Fe3O4-L可有效靶向至淋巴结，且靶向作用是由纳米Fe3O4所介导的。对荷瘤小鼠进行治疗，Ce6/Fe3O4-L介导的声动力治疗（SDT）联合PD-L1可有效抑制肿瘤生长，增强瘤内T细胞浸润，提高相关免疫因子水平，说明Ce6/Fe3O4-L介导的SDT可有效激活体内抗肿瘤免疫响应。同时证实，激活的免疫响应对远端瘤具有良好的治疗作用，并能有效抑制肿瘤细胞转移。本课题利用Fe3O4纳米粒作为纳米转运载体，将肿瘤组织内抗原高效靶向转运至淋巴结中，为增强肿瘤患者个体化免疫治疗提供了一个很好的策略。
2.构建免疫佐剂纳米粒子P2PMs以增强基于肿瘤细胞抗肿瘤疫苗的免疫治疗作用
肿瘤作为一种突变性疾病，也可以利用疫苗进行预防治疗。肿瘤细胞包含了肿瘤所有已知与未知的抗原，因此“失活”的肿瘤细胞可以作为抗肿瘤疫苗一种理想的抗原来源，以实现个体化免疫治疗。然而迄今为止基于肿瘤细胞的抗肿瘤疫苗仍处于临床研究阶段，其中一个关键问题是如何增强肿瘤细胞上抗原的有效呈递。佐剂作为疫苗的主要组成成分，不仅可以增强抗原免疫原性，同时辅助免疫响应激活。随着对免疫学的深入研究，意识到抗原与免疫佐剂空间共传递是增强抗原呈递的关键所在。然而目前使用的免疫佐剂多为小分子，这种形式的佐剂很难与肿瘤细胞抗原共同传递。因此，本课题希望通过纳米技术，解决基于肿瘤细胞抗肿瘤疫苗的抗原呈递问题。
本课题将具有潜在免疫佐剂性质的PEI与PLGA嫁接并共同形成阳离子纳米粒P2PMs。考虑到抗原呈递细胞（APCs）细胞只能吞噬较小的物质，因此将肿瘤细胞制备成200nm左右的囊泡TEVs。联想到两种纳米粒子所带电荷相反，本课题将阳离子纳米粒P2PMs与呈负电性质的TEVs通过静电作用形成纳米网（P2PMs-TEVs）。实验证实，制备的P2PMs具有较好的免疫佐剂特性，一方面P2PMs可以实现抗原胞内释放，促进DCs成熟，另一方面P2PMs能够延长抗原呈递，这可能与其调控吞噬体内pH有关。另外，课题组首次观察到P2PMs-TEVs纳米网与DCs作用后，DCs可同时吞入多个P2PMs与TEVs纳米粒子于一个吞噬体内，这为增强抗原呈递尤其是大型抗原的呈递开辟了新的思路。
为进一步增强疫苗在体内的抗肿瘤免疫应答，本课题利用微米级SiO2棒与P2PMs-TEVs纳米网共同搭建成一个具有3D结构的疫苗，同时在SiO2棒上负载GM-CSF，最后制备成3D疫苗（SiO2@GM/P2PMs-TEVs）。将疫苗皮下接种到小鼠体内后，SiO2搭建的3D骨架联合GM-CSF可有效招募DCs于疫苗接种部位，在P2PMs佐剂作用下，DCs被大量刺激成熟。同时，成熟的DCs可有效转运至淋巴结中，促使淋巴结内的T淋巴细胞大量增殖，且外周血中的IFN-γ+CD8+细胞含量也大幅度增加，说明SiO2@GM/P2PMs-TEVs疫苗可有效激发机体内免疫应答。随后对荷瘤小鼠进行治疗，SiO2@GM/P2PMs-TEVs疫苗联合PD-L1抗体治疗，可有效抑制肿瘤增殖，瘤内浸润的T淋巴细胞分析结果显示，抗肿瘤作用主要由T细胞介导的，同时SiO2@GM/P2PMs-TEVs疫苗可有效降低瘤内Treg细胞含量，为免疫治疗创造了有利条件。本课题通过构建具有免疫佐剂性质的纳米粒，将免疫佐剂纳米粒（A）与肿瘤细胞囊泡抗原（B）以纳米网A@B结合的形成共同呈递给APCs，为实现肿瘤细胞形式的抗原与佐剂空间共传递提供了新的设计思路。
1.基于纳米Fe3O4实现肿瘤内源性抗原淋巴结靶向转运以增强肿瘤个体化免疫治疗研究
目前，大多数抗肿瘤免疫治疗依靠外源性抗原输入以获得抗肿瘤免疫应答，但肿瘤作为高突变性疾病，常常会导致一个或多个抗原缺失，患者之间抗原无法共享，因此，使用固定的一个或多个抗原很难对肿瘤进行个体化免疫治疗。利用患者自身抗原是实现个体化免疫治疗最直接有效的途径，但肿瘤组织内免疫抑制微环境的存在，使在肿瘤组织中直接呈递抗原将很难产生有效的免疫应答。基于此，本课题希望通过纳米载体，将肿瘤内源性抗原转运至淋巴器官，以增强个体化免疫治疗。得益于小粒径纳米粒子（＜50nm）可自由通过淋巴管到达淋巴结，本课题选择了生物相容性较好的纳米Fe3O4（≈10nm）为潜在的纳米转运载体，以将肿瘤组织内的抗原转运至淋巴结中。实验结果证明选择的Fe3O4纳米粒不仅具有较强的蛋白吸附效率，且能够有效靶向至淋巴结，可以作为一种潜在的淋巴结靶向转运载体。
为确保Fe3O4纳米粒在肿瘤组织内具有最佳的蛋白结合效率，本课题将脂质体作为Fe3O4纳米粒保护层，同时在磷脂双分子层内部负载声敏剂Ce6（Ce6/Fe3O4-L），以实现纳米Fe3O4在肿瘤组织超声响应性释放。通过实验证实，Fe3O4纳米粒被成功包载在脂质体内核中，在超声作用下，Ce6/Fe3O4-L可大量产生活性氧（ROS）。这些ROS不仅可以诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡（ICD），同时促使Fe3O4释放。同时证实，释放的Fe3O4纳米粒仍具有较强的蛋白吸附作用，且吸附的蛋白中含有大量的肿瘤相关性抗原。
小鼠体内分布实验证实，超声作用后，Ce6/Fe3O4-L可有效靶向至淋巴结，且靶向作用是由纳米Fe3O4所介导的。对荷瘤小鼠进行治疗，Ce6/Fe3O4-L介导的声动力治疗（SDT）联合PD-L1可有效抑制肿瘤生长，增强瘤内T细胞浸润，提高相关免疫因子水平，说明Ce6/Fe3O4-L介导的SDT可有效激活体内抗肿瘤免疫响应。同时证实，激活的免疫响应对远端瘤具有良好的治疗作用，并能有效抑制肿瘤细胞转移。本课题利用Fe3O4纳米粒作为纳米转运载体，将肿瘤组织内抗原高效靶向转运至淋巴结中，为增强肿瘤患者个体化免疫治疗提供了一个很好的策略。
2.构建免疫佐剂纳米粒子P2PMs以增强基于肿瘤细胞抗肿瘤疫苗的免疫治疗作用
肿瘤作为一种突变性疾病，也可以利用疫苗进行预防治疗。肿瘤细胞包含了肿瘤所有已知与未知的抗原，因此“失活”的肿瘤细胞可以作为抗肿瘤疫苗一种理想的抗原来源，以实现个体化免疫治疗。然而迄今为止基于肿瘤细胞的抗肿瘤疫苗仍处于临床研究阶段，其中一个关键问题是如何增强肿瘤细胞上抗原的有效呈递。佐剂作为疫苗的主要组成成分，不仅可以增强抗原免疫原性，同时辅助免疫响应激活。随着对免疫学的深入研究，意识到抗原与免疫佐剂空间共传递是增强抗原呈递的关键所在。然而目前使用的免疫佐剂多为小分子，这种形式的佐剂很难与肿瘤细胞抗原共同传递。因此，本课题希望通过纳米技术，解决基于肿瘤细胞抗肿瘤疫苗的抗原呈递问题。
本课题将具有潜在免疫佐剂性质的PEI与PLGA嫁接并共同形成阳离子纳米粒P2PMs。考虑到抗原呈递细胞（APCs）细胞只能吞噬较小的物质，因此将肿瘤细胞制备成200nm左右的囊泡TEVs。联想到两种纳米粒子所带电荷相反，本课题将阳离子纳米粒P2PMs与呈负电性质的TEVs通过静电作用形成纳米网（P2PMs-TEVs）。实验证实，制备的P2PMs具有较好的免疫佐剂特性，一方面P2PMs可以实现抗原胞内释放，促进DCs成熟，另一方面P2PMs能够延长抗原呈递，这可能与其调控吞噬体内pH有关。另外，课题组首次观察到P2PMs-TEVs纳米网与DCs作用后，DCs可同时吞入多个P2PMs与TEVs纳米粒子于一个吞噬体内，这为增强抗原呈递尤其是大型抗原的呈递开辟了新的思路。
为进一步增强疫苗在体内的抗肿瘤免疫应答，本课题利用微米级SiO2棒与P2PMs-TEVs纳米网共同搭建成一个具有3D结构的疫苗，同时在SiO2棒上负载GM-CSF，最后制备成3D疫苗（SiO2@GM/P2PMs-TEVs）。将疫苗皮下接种到小鼠体内后，SiO2搭建的3D骨架联合GM-CSF可有效招募DCs于疫苗接种部位，在P2PMs佐剂作用下，DCs被大量刺激成熟。同时，成熟的DCs可有效转运至淋巴结中，促使淋巴结内的T淋巴细胞大量增殖，且外周血中的IFN-γ+CD8+细胞含量也大幅度增加，说明SiO2@GM/P2PMs-TEVs疫苗可有效激发机体内免疫应答。随后对荷瘤小鼠进行治疗，SiO2@GM/P2PMs-TEVs疫苗联合PD-L1抗体治疗，可有效抑制肿瘤增殖，瘤内浸润的T淋巴细胞分析结果显示，抗肿瘤作用主要由T细胞介导的，同时SiO2@GM/P2PMs-TEVs疫苗可有效降低瘤内Treg细胞含量，为免疫治疗创造了有利条件。本课题通过构建具有免疫佐剂性质的纳米粒，将免疫佐剂纳米粒（A）与肿瘤细胞囊泡抗原（B）以纳米网A@B结合的形成共同呈递给APCs，为实现肿瘤细胞形式的抗原与佐剂空间共传递提供了新的设计思路。