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人体组织中端粒酶(Telomerase)的表达具有特异性分布特点，胚系细胞、成体干细胞、永生化细胞和恶性肿瘤细胞中均有端粒酶活性的表达，而正常体细胞中则无活性的端粒酶。转染外源性端粒酶逆转录酶(TERT)可以激活端粒酶活性，维持端粒长度，诱导细胞永生化。目前学者们通过转染外源性TERT已经成功获得多个永生化细胞株，如成纤维细胞、视网膜色素上皮细胞、前列腺上皮细胞、内皮细胞、乳腺上皮细胞等。但是对于外源性TERT基因致上皮细胞永生化的机制尚不明确。
目的：采用编码人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的逆转录载体分别感染口腔黏膜上皮(OME)细胞和HaCaT细胞，构建hTERT+-OME和hTERT+-HaCaT永生化细胞株，通过检测转染后永生化细胞株p16、p21、p53和Bmi-1的表达变化，探讨外源性hTERT致上皮细胞永生化的分子机制。
方法：⑴pLXSNneo-hTERT逆转录病毒载体由本课题组构建，包装PA317细胞后，获得含hTERT基因重组逆转录病毒的高病毒滴度产毒细胞系，于本实验室-80℃冰箱保存。⑵收取黏膜上皮组织，Dispase酶及胰酶双重消化法制备上皮单细胞悬液，角化细胞无血清培养基(Keratinocyte-serum free medium，K-SFM)培养。免疫细胞化学(Immunocytochemistry，ICC)鉴定细胞的上皮来源。HaCaT细胞系由中山大学医学院生理实验室提供。⑶收集病毒包装细胞PA317的培养上清液，分别感染OME和HaCaT细胞，G418筛选抗性克隆，扩增培养，获得永生化hTERT+-OME细胞株以及hTERT+-HaCaT细胞株。永生化成釉细胞瘤细胞株hTERT+-AM本实验室-80℃冰箱保存。⑷采用倒置显微镜观察细胞形态；ICC检测广谱细胞角蛋白(PAN-cytokeratin，pCK)、波形蛋白(Vimentin，Vim)表达；绘制细胞生长曲线；计算细胞群体倍增时间(Doubling Time，DT)及群体倍增数(Population Doublings，PDL)，绘制细胞倍增曲线；两步法逆转录-聚合酶链反应(Reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测转染前后OME和HaCaT细胞中hTERT、p16、p21、p53和Bmi-lmRNA的表达情况；Western blot检测转染前后OME和HaCaT细胞中hTERT、p16、p21、p53和Bmi-1蛋白的表达情况；以2×106个细胞接种裸鼠检测肿瘤形成。
结果：①原代培养的OME细胞于5-6d后铺满六孔板底壁，呈典型的“铺路石”样，ICC鉴定pCK阳性、Vim阴性。②转染hTERT基因后形成的hTERT+-OME及hTERT+-HaCaT细胞保持了上皮特性；细胞生长曲线显示细胞分裂增殖迅速，很快即进入对数生长期；倍增曲线表现出无限细胞系的特点，两个细胞株PDL值均超过80；裸鼠成瘤实验均未见成瘤。③RT-PCR及Western Blot结果显示转染后的OME及HaCaT细胞中hTERT和Bmi-1表达上调，p16表达缺失，p53和p21表达基本不变。
结论：⑴转入外源性hTERT基因可以诱导口腔黏膜上皮细胞和HaCaT细胞永生化，并保持上皮细胞来源的特性，可在体外稳定持续增殖。⑵外源性hTERT基因通过激活Bmi-1转录诱导p16表达下调。⑶p16表达缺失可使细胞分裂增殖速度加快。