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我国是肝癌发病率最高的国家之一。肝癌早期症状隐匿，确诊时多为中晚期，手术切除并非适合所有肝癌患者。如今许多国家将肝移植列为肝脏终末期疾病的常规手术。在我国目前肝癌肝移植约占肝移植总量的1/3，只要严格控制肝癌肝移植的手术适应症，合理选择肝移植病人，以肝脏肿瘤为适应症的肝移植疗效可以媲美以良性终末期肝病为适应症的肝移植疗效，但预防肝移植术后肝癌复发是提高肝癌肝移植术后长期生存的关键。
目前常用的方法是肝移植术后尽早实施全身性的辅助性化疗，但肝癌细胞的高度异质性造成肝癌细胞对传统化疗药的高度耐药，肝癌患者接受全身盲目单药化疗的有效率仅为0～17％，全身盲目化疗药联合化疗的治疗有效率也仅为0～28.5％，肝癌肝移植术后盲目化疗使患者受惠极少。我们的前期研究表明，肝癌肝移植术后采用个体化化疗方案可使患者肿瘤复发时间延迟，在一定程度上延长生存时间，但长期疗效还需进一步观察，并且部分患者对化疗药物的副作用难以耐受。因此，如能建立针对器官移植术围手术期肿瘤新发/复发的主动免疫，不断探索及研究新疗法在肝移植围手术期的应用对提高肝癌肝移植术后长期生存率具有重要意义。
本研究选取广谱、特异性靶向基因(端粒酶蛋白亚单位)，在体内、体外两个水平上，采用基因工程、分子生物学、流式细胞仪分析等技术，研究经端粒酶蛋白亚单位修饰的DC提高机体特异性抗肝癌免疫，增强机体免疫系统对肝癌抗原的加工、递呈及对肝癌细胞的特异性杀伤能力，为研制新型生物治疗方案，解决肝移植术后肝癌复发和新发的实际问题，从而提高综合疗效及长期生存率提供实验和理论依据。
第一部分：携带小鼠端粒酶蛋白亚单位基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建
目的：构建小鼠端粒酶蛋白亚单位(mousetelomerasereversetranscriptase，mTERT)基因重组腺病毒载体，为下一步研究其体外表达和动物实验研究提供基础。
方法：从肝癌细胞中提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增mTERT的基因编码区序列，将序列定向克隆至真核表达载体pAC，将此表达质粒与腺病毒重组质粒pJM17共同转染293细胞，经同源重组产生重组腺病毒载体Ad-mTERT，纯化后的重组腺病毒载体Ad-mTERT在293细胞大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化，测定病毒滴度。
结果：PCR及酶切证实：mTERTDNA正确克隆到穿梭质粒pAC中，带mTERTDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组E1A缺失区，并在293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒Ad-mTERT。
第二部分：小鼠骨髓来源DC的体外诱导及AdmTERT作用于DC的生物学效应研究
目的：建立体外大量扩增树突状细胞(DC)的方法，并对DC进行形态学和免疫学性质鉴定；并进一步研究AdmTERT转染DC后对其免疫功能的影响。
方法：应用IL-4、GM-CSF培养小鼠骨髓细胞5～7d，从形态、表型及功能上加以鉴定。用腺病毒作为介质，将AdmTERT转染入DC，流式细胞仪检测细胞表面分子CD11c、CD86、CD80、Iab、CD54，比较AdmTERT转染DC前后表型的变化；RT-PCR检测腺病毒转染DC后mTERT在DC中的表达；并与同种异体T细胞混合培养72h，终止培养前16h加入3H-TdR(0.5uCiP孔)，γ-液体闪烁仪测定cpm值，检测混合淋巴细胞反应中对同种异型T细胞的刺激能力。
结果：IL-4、GM-CSF培养3d可见细胞形态发生改变，细胞形状不规则，培养5～6d时，有刺状突起、拉长，为典型树突状细胞形态学特征；电镜下观察其绝大多数为特征性星形，且有1～4级不等的树突状突起,DC在功能上明显刺激同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)。AdmTERT转染，DC其转染效率可达90％以上，通过RT-PCR进一步验证腺病毒转染DC后mTERT在DC中呈阳性表达，流式细胞仪检测发现腺病毒载体转染DC后，对CD11、MHC-Ⅱ类分子和CD54的表达无明显影响，但能提高DC表面共刺激分子CD80(85.6％±0.12％)、CD86(87.2％±0.25％)的表达(P＜0.05)，在混合淋巴细胞反应中对同种异型T细胞的刺激能力显著增强(P＜0.05)。
第三部分：AdmTERT致敏的DC体外诱导TERT阳性肿瘤特异性细胞免疫应答
目的：用携带mTERT基因的重组腺病毒(AdmTERT)转染树突状细胞(DC)激发特异性细胞毒性T细胞(CTL)，分析CTL的特性。
方法：用AdmTERT重组腺病毒转染小鼠体外培养的DC，与自体来源的T细胞混合培养，每隔7天进行一轮刺激，共3轮刺激，末次刺激后的7天收集细胞，使用免疫磁珠阳性分选CD8+T细胞做为效应细胞，用INF-γELISPOT法、51Cr释放法进行特异性T细胞的检测，探讨体外是否可以诱导出抗原特异性的CTL。
结果：通过51Cr释放法的检测，发现经AdmTERT修饰的DC刺激三轮后所培养的T细胞能杀伤TERT阳性的小鼠肝癌细胞H22，而Ad-LacZ致敏的DC组和未致敏DC组的效应细胞却未显示出明显杀伤效应(P＜0.05)；ELISA结果发现用AdmTERT转染DC致敏的淋巴细胞再用AdmTERT/DC重复刺激时可以分泌IFN-γ，而且分泌量高于二次刺激采用无关抗原Ad-LacZ/DC或空白DC时分泌的IFN-γ(P＜0.05)。INF-γELISPOT法的结果也表明AdmTERT修饰的DC刺激后诱导出分泌INF-γ的特异性T细胞的数量显著高于Ad-LacZ致敏的DC组和未致敏DC组(P＜0.05)。
第四部分：AdmTERT致敏的DC体内诱导抗原特异性抗肿瘤效应
目的：探讨复制缺损型腺病毒载体介导mTERT修饰的树突状细胞(DCs)在体内诱导出mTERT抗原特异性的抗肿瘤效应。
方法：选用小鼠肝癌种植模型，AdmTERT、Ad-LacZ体外致敏小鼠的BMDC，用体外致敏的DC对同系小鼠进行免疫。将32只BALB/C小鼠随机分成4组，每组8只，每只小鼠同侧后腿皮下注射1×106经AdmTERT、Ad-LacZ致敏的同系小鼠的BMDC，另设DC组、PBS组，然后于第7d和第14d分别强化注射1次，剂量同上。距最后一次免疫14d后取脾细胞行51Cr释放实验，检测特异性CTL杀伤活性；给免疫小鼠接种H22肝癌细胞，观察肿瘤大小及荷瘤小鼠成活情况。为尽可能模拟临床的情况，进一步验证在肿瘤存在的情况下，AdmTERT修饰的DCs是否能够有效抑制肿瘤生长。在每只小鼠后右侧背部皮下接种处于对数生长期的H22细胞，剂量为1×106细胞/只。上述小鼠接种H22肿瘤细胞后三天，按接受治疗不同，将32只BALB/C小鼠随机分成4组，每组8只，实验分组及免疫方法同上。治疗期间每隔两天观察肿瘤出现及生长情况。
结果：AdmTERT致敏DC免疫BALB/C小鼠产生了抗原特异性的Th1型免疫反应，其中AdmTERT组IL-2的水平和INF-γ分泌细胞的数量显著高于Ad-LacZ组(P＜0.05)；同时DC组脾细胞分泌IL-2的水平和INF-γ分泌细胞的数量未见升高，而PBS组小鼠脾细胞不能显著诱导产生IL-2和INF-γ；AdmTERT修饰的DCs诱发小鼠产生特异性的CTL，AdmTERT修饰的DCs能诱导特异性CTL的产生，其CTL对靶细胞的杀伤效率与E∶T比例成正比。在相同的E∶T比例下，AdmTERT/DCs诱发产生CTL杀伤率明显地强于Ad-LacZ/DCs，而未致敏的DC免疫组和PBS组的效应细胞对靶细胞没有明显杀伤活性，表明用Ad介导mTERT修饰DCs能更有效地诱发针对mTERT的抗原特异性细胞免疫反应；AdmTERT修饰的DCs免疫提高了小鼠的存活率，PBS组和未处理DCs组肿瘤生长迅速，小鼠1-2周内全部有肿瘤生长；Ad-LacZ/DCs组肿瘤生长似乎稍有延迟，但2-3周内全部有肿瘤生长；AdmTERT/DC组每只小鼠接种1×106H22细胞后观察2个月仍有40％的小鼠无瘤生长。观察至第27天时，此组中出现肿瘤生长的小鼠的肿瘤平均直径明显低于各对照组小鼠的肿瘤平均直径(P＜0.05)。Ad-LacZ/DCs组、PBS组和未处理DCs组免疫的小鼠在荷瘤第28天至第67天之间全部死亡，而在第60天，AdmTERT修饰的DCs组的小鼠存活率为62.5％，观察到第90天，此组小鼠的存活率仍为37.5％，且存活小鼠体内未观察到有肿瘤生长，表明AdmTERT修饰的DCs免疫小鼠，可以显著抑制小鼠体内肿瘤生长，而且提高小鼠的存活率。
结论：1.成功构建出携带小鼠端粒酶蛋白亚单位(mTERT)基因的重组腺病毒载体(AdmTERT)，为研究其用于肿瘤的基因治疗奠定基础。
2.通过细胞因子诱导出树突状细胞，并分别从形态、表型及功能上加以证明。AdmTERT转染DC能提高DC表面共刺激分子CD80、CD86的表达，增加对同种异体T细胞的刺激能力；增强了对抗原的呈递和活化。
3.AdmTERT修饰的DC体外能够诱导出针对mTERT抗原特异性的CTL效应，可特异性杀伤TERT阳性的肿瘤细胞。
4.AdmTERT修饰的DC在小鼠体内可诱导出特异性的抗肿瘤活性，对肿瘤的发生有预防和治疗作用，可延长小鼠的生存期。