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黄病毒科(Flaviviridea)为有包膜的单股线型的正链RNA病毒，基因组长度为9.6-12.3kb，5'端带有的核苷酸带有甲基化的帽子。病毒主要感染哺乳类动物。病毒颗粒具有外膜，直径约40-60nm。该科病毒主要包括：登革病毒(DengueVirus)、日本脑膜炎病毒(Japaneseencephalitisvirus)、牛科病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus)、丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus)等。其中登革病毒属虫媒病毒，由四种小同血清型的病毒组成，DV1～4。主要通过蚊子叮咬进行人际间传播。登革病毒的主要高发和传播地域包括热带和部分哑热带地区。登革病毒每年约感染10万人，其中在新生儿中致死率较高。登革病毒感染导致一系列的临床疾病，主要包括登革热(Denguefever，DF)以及危及生命的登革出血热和登革休克症(Denguehemorrhagicfever/DengueshocksyndromeDHF/DSS)。登革病毒导致的疾病目前没有有效的治疗药物，临床治疗方法主要以支持性疗法为主，维持水、电解质平衡，对于有出血倾向的病人，合并止血药物治疗。 本实验室通过RealtimePCR，CPE等方法，在BHK-21等细胞模型上对多种化合物进行了抗登革病毒活性的检测，研究发现了一种硫酸化天麻多糖化合物WSS45和一个小分子喹唑啉类非核苷类似物1157，都具有良好的体外抗登革病毒的活性。 其中，天麻多糖硫酸化产物，WSS45体外能强烈抑制DV2病毒在BHK-21细胞上的感染及病毒的复制，在10μg/ml时，WSS45能完全抑制DV2感染宿主细胞以及病毒的复制，显著降低上清中病毒RNA含量(至十万分之一)，同时化合物没有任何细胞毒性，其抗病毒活性强于阳性对照化合物霉酚酸，WSS45的IC500.68±0.17μg/ml，CC50>3000μg/ml，S1>1000。在病毒感染和胞内复制不同阶段的给药研究发现，病毒感染细胞后加入WSS45则对病毒的扩增以及病毒空斑的形成没有明显的抑制作用，不影响病毒蛋白的胞内表达。说明WSS45主要作用在病毒对细胞的感染阶段。进一步通过空斑形成实验结合温度控制阻碍病毒穿膜及酸处理灭活胞外病毒的方法，我们分别观察了WSS45在病毒对靶细胞的感染过程，吸附和穿膜过程的影响，发现WSS45能显著抑制DV2病毒体外感染BHK-21细胞，其作用主要为阻断病毒对靶细胞的吸附，而对病毒穿膜有较弱的抑制作用。将WSS45预先和病毒孵育并用蔗糖梯度离心除去WSS45后，DV2病毒的感染性没有受到化合物的影响，说明WSS45无直接使病毒失活的作用。WSS45预先和细胞孵育也不能保护细胞免受后续感染，但是在病毒吸附BHK-21后加入WSS45依然能有效降低病毒感染。DV2吸附上BHK-21细胞后再加入WSS45能显著减少DV2在BHK-21细胞表面的残留，并且病毒RNA的降低和细胞感染数的降低相一致，说明WSS45能致使病毒从细胞表面解离和脱落。以DV2病毒表面E蛋白抗体进行免疫荧光染色观察细胞表面结合的病毒颗粒也确认到这一现象。综上结果，WSS45显著干扰DV2在BHK-21细胞表而吸附和结合能力，干扰DV2病毒在细胞表面的结合，促进其解离。因此，WSS45是一个具有良好抗病毒活性的硫酸多糖化合物，其抗病毒作用机制为干扰感染病毒和靶细胞间的吸附。 另一方面，在对小分子非核苷类抗病毒化合物的研究中，我们发现了一个基于喹唑啉母核的全合成化合物1157，具有良好的抗登革病毒活性。该化合物在C6/36细胞系上能显著抑制DV2病毒的复制，其在0.2μM下即可完全抑制病毒感染造成的细胞病变和死亡，同时在该细胞系上CC50>10μM。在Huh7细胞上，化合物1157能显著降低DV2感染细胞卜清中的病毒滴度，抑制新生病毒的产生，且对DV3病毒在具有相似的效果，IC50约为0.76μM。CC50约为35.80μM。Westernblotting结果显示化合物1157降低胞内DV2病毒蛋白的表达。化合物1157显著降低胞内病毒E蛋白阳性细胞的比率，效果优于对照药Ribavirin及Mycophenolicacid。在DV2感染后通过不同时间段加入化合物并检测终点病毒RNA含量，确认化合物1157并非通过阻碍病毒感染及早期病毒RNA释放过程来发挥其抗病毒作用。化合物1157能对胞内病毒蛋白的表达或者子代RNA的复制起直接抑制作用。化合物1157不影响病毒报告RNA转染细胞后的翻译，因此不阻断病毒基因组的正常翻译。为了了解化合物1157对病毒NS3蛋白酶活性的影响，构建NS3蛋白酶活性报告质粒，以Luciferase为报告基因。转染Huh7细胞后加入化合物，化合物1157对Luciferase活性没有明显影响。说明化合物1157不抑制NS3蛋白酶活性。为了了解化合物1157对病毒RNA合成的影响，以BrU掺入新合成的的病毒RNA，再通过特异性抗体检测新生RNA，发现化合物1157对Huh7细胞正常RNA合成没有抑制作用，但是能显著降低病毒RNA的BrU入速率，抑制病毒RNA合成。提示化合物1157直接阻断病毒RNA的合成过程。进一步分离病毒RNA合成复制体，体外重构RNA复制环境，通过氚代UTP掺入检测病毒的RNA依赖RNA聚合酶活性，发现化合物1157的加入能显著降低放射标记的UTP掺入到新生病毒RNA链中，说明其商接抑制病毒复制体的功能，阻断病毒RNA合成。此外，化合物1157在抗HCV病毒的实验中，也显示出了优异的抗病毒活性，IC50约为0.46μM，CC50约为35μM。化合物1157能降低HCV感染的Huh7.5.1胞内病毒蛋白的表达，减少上清中子代病毒滴度。提示其可能具有直接抑制病毒复制的能力，具体的抗病毒机制有待进一步研究。综上所述，化合物1157是一个具有良好开发前景、具备抗黄病毒科病毒活性的先导化合物，其详细分子靶点有待进一步研究。