论文部分内容阅读
褪黑素（Melatonin;N-乙酰-5-甲氧基色胺）是色氨酸的天然衍生物,且是几乎所有生物体（包括动物和植物）体内合成的中心生物分子,其结构中具有吲哚杂环,可与羟基（-OH）和烷基过氧自由基（ROO-）等反应。褪黑素可以作为抗氧化剂参与许多细胞行为,在生物体外和体内都是极好的自由基清除剂,参与并协助植物体对各种非生物胁迫环境的的保护响应活动。植物藻类中的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是一种单细胞真核绿藻（团藻目,衣藻属）,生长速度快,具有完成测序的基因组和简单的分子遗传学特性,成为很受欢迎的微藻模式生物,被用于植物功能基因及次生代谢产物等方面的研究,然而有关微藻中褪黑素的相关研究仍然比较薄弱。本研究以模式微藻中的莱茵衣藻为受体,分别进行了外源褪黑素和内源褪黑素过量表达两种情况下对莱茵衣藻响应盐胁迫的生理作用,旨在探讨盐胁迫的非生物胁迫环境中,褪黑素对微藻生长的保护力,为微藻中褪黑素的功能研究提供参考。论文一方面研究了在不同浓度的外源褪黑素的情况下,主要选用藻类生长,形态观察,膜脂过氧化,抗氧化酶活性和细胞内褪黑素浓度为测量指标,考察莱茵衣藻对盐胁迫的响应。另一方面通过构建褪黑素关键合酶基因AANAT（Arylalkaylamine-N-Acetyltransferase,芳基烷基胺N-乙酰基转移酶）的衣藻核表达载体pDBle-AANAT,以莱茵衣藻为受体,借助玻璃珠转化法将AANAT导入该模式微藻基因组中;进而经抗性筛选、培养、PCR及qRT-PCR等方法鉴定转化藻株,得到AANAT转基因藻株;检测转基因藻株与未转化藻株中褪黑素含量的变化,分析AANAT过量表达的藻株在盐胁迫条件下所具有的抗氧化能力。主要研究结果如下:（1）外源褪黑素对莱茵衣藻盐胁迫下的防护作用:（1）在100 mM NaCl盐胁迫的处理中,0.1μM和1μM的MT促进莱茵衣藻细胞的生长,10μM和100μM的MT抑制莱茵衣藻细胞的生长;（2）1μM的MT可以帮助衣藻维持其在不利环境条件（盐胁迫）下的细胞聚集体形态;（3）0.1μM、1μM和10μM的MT可以增加藻细胞抗氧化系统中的SOD、CAT和POD酶活性,帮助莱茵衣藻消除有毒物质,同时可以通过降低衣藻细胞的膜过氧化产物MDA的水平,缓解细胞氧化损伤。（2）构建了含AANAT的莱茵衣藻核表达载体pDBle-AANAT:将质粒PUCK-AANAT和pDBle经过Nde I和EcoR I双酶切及T4-DNA连接酶连接后得到重组质粒pDBle-AANAT。经过PCR、双酶切验证载体构建成功。（3）莱茵衣藻的遗传转化及筛选鉴定,获得转化藻株:将重组质粒pDBle-AANAT通过玻璃珠转化法导入缺壁型莱茵衣藻核基因组中。转化藻株经过博来霉素（Ble）抗性筛选培养之后,再提取转化衣藻的DNA和RNA,分别进行Ble基因PCR检测及AANAT基因表达水平qRT-PCR的检测等方法,最终确定得到阳性的AANAT转化莱茵衣藻藻株Tn（n为不同转基因系）。（4）AANAT转基因藻株（内源褪黑素）在盐胁迫处理中的生理保护响应:（1）测定了不同AANAT转化藻株系细胞内褪黑素浓度,发现转化藻株（T1、T2、T4、T5、T6、T8）中褪黑素浓度均极显著（P<0.01）的高于未转化藻株;（2）在100 mM NaCl胁迫环境中,相比未转化藻株,不同藻株系（T1、T2、T4、T5、T6、T8）抗氧化系统相关指标受到影响,其中细胞内三种抗氧化酶CAT、SOD、POD的活性在P<0.01水平上呈现极显著升高,细胞内丙二醛的含量在P<0.01水平上是显著降低的。