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我国大部分苹果产区的持续健康发展都受到了苹果病毒病的制约。据调查和检测，苹果产区绝大多数植株为复合侵染，多数病毒为潜隐病毒，无明显症状，其中苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)，果实表现明显症状，近年该病害逐渐上升为主要病害，且尚无有效防治药剂。不同苹果品种被ASSVd侵染后的症状有明显差异，且常有隐症现象。症状的差异是否与病毒种类的多少及所占比例有关？是否与ASSVd分子变异有关？为了验证这些假想，本研究选取苹果锈果病症状有明显差异的不同苹果品种、同一品种显症及未显症植株，从病毒种类、病毒来源的small RNA（virus-derived small interfering RNA，vsiRNA）特性及ASSVd基因组变异几个角度入手，一方面探究了不同苹果品种ASSVd症状差异的原因;另一方面通过探究复合侵染后的vsiRNA特性为研究小分子RNA的合成机制和生物学功能提供重要的参考信息，以期发现果树的抗病毒通路，为抗病毒研究提供新思路。对不同品种ASSVd分子变异位点的分析也为进一步揭示类病毒的致病机理提供了理论基础，为病毒的分类、诊断、及防治提供了依据。主要研究结果如下:
1、锈果病症状不同的苹果植株病毒种类及vsiRNA read数量分析。在保定地区选择树龄相似、具有严重锈果病症状的王林、斗南、中秋王三个品种、同一植株上嫁接的富士和金冠品种，同时采集携带ASSVd的显症及未显症王林品种，同一时期采取同一部位的一年生枝皮组织进行高通量测序分析，结果表明:(1)各样本均主要为苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、苹果茎沟病毒(Apple stemgrooving virus，ASGV)、苹果茎痘病毒（Apple stempitting virus，ASPV）和ASSVd的复合侵染，病毒种类基本一致。说明不同品种症状的差异以及同一品种显症与否不取决于病毒种类的差异;(2)从vsiRNAreads数量角度分析，斗南、中秋王的vsiRNA数量排列顺序均为AS SVd＞ASPV＞ASGV＞ACLSV，王林的vsiRNA数量排列顺序为AS SVd＞ASPV＞ACLSV＞ASGV;同一植株金冠和富士vsiRNAreads数量的排序为ASSVd＞ACLSV＞ASGV＞ASPV;显症王林和未显症王林vsiRNA reads数量排序均为AS SVd＞ASPV＞ACLSV＞ASGV。从不同品种各病毒vsiRNAreads数量上未发现任何规律，值得思考的是显症王林除ASPV外，其它三种病毒vsiRNA reads数量明显高于未显症植株，尤其是ASSVd。
2、锈果病症状不同的苹果植株vsiRNA长度分布、5端碱基偏好性及GC含量分析。王林、斗南、中秋王三个品种、同一植株上嫁接的富士和金冠品种ASSVd、ASPV、ACLSV、ASGV均以21nt和22nt vsiRNA reads数量较高，显症王林和未显症王林相比，显症王林ASSVd、ASPV、ACLSV、ASGV的21nt和口22nt vsiRNA reads数量较高，未显症王林20nt和21nt的vsiRNA reads数量较高。说明苹果植株中可能存在有拟南芥相似的Dicer同源蛋白(Dicer-like，DCL)。显症各品种苹果植株DCL4和DCL2内切酶起主要作用，预测它们可能参与到苹果的抗病毒通路中;未显症王林DCL4起主要作用，另外20nt vsiRNA可能由其它未阐明或与拟南芥不同的抗病毒路径产生。各品种显症植株及未显症王林植株中ASSVd、ASPV、ACLSV、ASGV4种病毒small RNA5端多以碱基U起始的21nt vsiRNA占比最多，除中秋王和斗南ASSVd21nt vsiRNA5端是以碱基C起始占比最多。因此，根据RNA沉默通路中RNA诱导沉默复合物(RISC)核心成员Argonaute(AGO)的碱基偏好性，推测多数病毒可能是由AG01定位后发生沉默，中秋王和斗南的ASSVd主要是AGO5起作用。AGO偏好高G含量的vsiRNA，vsiRNA GC含量决定着寄主对病毒的沉默效应，王林、斗南、中秋王品种，未显症王林、高接前后的金冠和富士，4种病毒vsiRNA平均GC含量均为ASSVd最高，在55％左右，ASPV、ACLSV、ASGV很相近，均在40％左右。品种之间没有明显差异，显症与未显症植株之间也没有明显差异。
3、锈果病症状不同的苹果植株ASSVd来源的vsiRNA序列寄主靶基因预测及分析。选择长度为21nt、reads数量＞10的vsiRNA序列进行GO和KEGG富集分析，结果表明，5个品种ASSVd的small RNA预测得到的靶基因涉及到肌醇五磷酸二激酶的活性、过氧化物酶体组织有关、葡萄糖-6-磷酸异构酶活性、木葡聚糖转移酶的活性、延伸相关的全酶复合体、焦磷酸硫胺素结合、糖衍生物结合等广泛的生物学过程和分子功能;主要涉及代谢途径、RNA转运、核糖体组分、mRNA监测途径、植物-病原体互作等途径。
4、不同品种苹果ASSVd分子变异分析。选择ASSVd侵染后的富士、斗南、王林、中秋王、金冠、信浓红、信浓黄品种，对ASSVd全基因组序列进行扩增和分子克隆，然后进行序列分析。我们共获得210个ASSVd的全长序列，共计17种分离物，大小为325-333nt。我们根据nt1-4、221、251、284、302这8个位点的碱基变异，将17种分离物分为6种类型，分别为:1:nt1-4(GGTA)+nt41-46(TAAAAT)+nt221(T)+nt251(T)+nt284(G)+nt302(T);2:nt1-3(GGT)+nt41-46(AGATAX)+nt221(T)+nt251(X)+nt284(A)+nt302(A);3:nt1-3(GGT)+nt41-46(AGATAX)+nt221(X)+nt251(X)+nt284(A)+nt302(A);4:nt1-3(GGT)+nt42-47(AGATAX)+nt221(T)+nt251(T)+nt284(A)+nt302(A);5:nt1-4(GGTA)+nt41-46(TAAAAT)+nt222(X)+nt251(G)+nt284(G)+nt302(T);6:nt1-4(GGTA)+nt1-46(TAAAAT)+nt221(T)+nt251(G)+nt284(G)+nt302(T)。X:表示缺失。富士品种包含6种类型，以碱基类型4为主(47.5％);王林品种包含3种类型，以碱基类型5为主(43％);金冠包含3种类型，以碱基类型4为主(60％);斗南品种为碱基类型5，占比100％;中秋王品种为碱基类型4，占比100％;信浓红包含两种类型，以碱基类型1为主(83.3％);信浓黄包含3种类型，以碱基类型1为主(62.5％)。我们进一步将保定地区获得的17种分离物与其他已发表代表性分离物进行分析，结果表明，保定分离物可以分为三组，组Ⅰ同已报道的保定富士分离物（KR264032.1）和北京富士分离物亲缘关系较近(HQ840722.1);组Ⅱ同已报道的印度樱桃上的分离物(FN669529.1)及朝鲜苹果分离物(EU825613.1)亲缘关系最近;组Ⅲ同已报道的希腊野生苹果上的分离物(FJ974099.1)及新疆红富士苹果上的分离物(EU031455.1)亲缘关系最近。未发现ASSVd具有明显的地区专化性和品种专化性。
1、锈果病症状不同的苹果植株病毒种类及vsiRNA read数量分析。在保定地区选择树龄相似、具有严重锈果病症状的王林、斗南、中秋王三个品种、同一植株上嫁接的富士和金冠品种，同时采集携带ASSVd的显症及未显症王林品种，同一时期采取同一部位的一年生枝皮组织进行高通量测序分析，结果表明:(1)各样本均主要为苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、苹果茎沟病毒(Apple stemgrooving virus，ASGV)、苹果茎痘病毒（Apple stempitting virus，ASPV）和ASSVd的复合侵染，病毒种类基本一致。说明不同品种症状的差异以及同一品种显症与否不取决于病毒种类的差异;(2)从vsiRNAreads数量角度分析，斗南、中秋王的vsiRNA数量排列顺序均为AS SVd＞ASPV＞ASGV＞ACLSV，王林的vsiRNA数量排列顺序为AS SVd＞ASPV＞ACLSV＞ASGV;同一植株金冠和富士vsiRNAreads数量的排序为ASSVd＞ACLSV＞ASGV＞ASPV;显症王林和未显症王林vsiRNA reads数量排序均为AS SVd＞ASPV＞ACLSV＞ASGV。从不同品种各病毒vsiRNAreads数量上未发现任何规律，值得思考的是显症王林除ASPV外，其它三种病毒vsiRNA reads数量明显高于未显症植株，尤其是ASSVd。
2、锈果病症状不同的苹果植株vsiRNA长度分布、5端碱基偏好性及GC含量分析。王林、斗南、中秋王三个品种、同一植株上嫁接的富士和金冠品种ASSVd、ASPV、ACLSV、ASGV均以21nt和22nt vsiRNA reads数量较高，显症王林和未显症王林相比，显症王林ASSVd、ASPV、ACLSV、ASGV的21nt和口22nt vsiRNA reads数量较高，未显症王林20nt和21nt的vsiRNA reads数量较高。说明苹果植株中可能存在有拟南芥相似的Dicer同源蛋白(Dicer-like，DCL)。显症各品种苹果植株DCL4和DCL2内切酶起主要作用，预测它们可能参与到苹果的抗病毒通路中;未显症王林DCL4起主要作用，另外20nt vsiRNA可能由其它未阐明或与拟南芥不同的抗病毒路径产生。各品种显症植株及未显症王林植株中ASSVd、ASPV、ACLSV、ASGV4种病毒small RNA5端多以碱基U起始的21nt vsiRNA占比最多，除中秋王和斗南ASSVd21nt vsiRNA5端是以碱基C起始占比最多。因此，根据RNA沉默通路中RNA诱导沉默复合物(RISC)核心成员Argonaute(AGO)的碱基偏好性，推测多数病毒可能是由AG01定位后发生沉默，中秋王和斗南的ASSVd主要是AGO5起作用。AGO偏好高G含量的vsiRNA，vsiRNA GC含量决定着寄主对病毒的沉默效应，王林、斗南、中秋王品种，未显症王林、高接前后的金冠和富士，4种病毒vsiRNA平均GC含量均为ASSVd最高，在55％左右，ASPV、ACLSV、ASGV很相近，均在40％左右。品种之间没有明显差异，显症与未显症植株之间也没有明显差异。
3、锈果病症状不同的苹果植株ASSVd来源的vsiRNA序列寄主靶基因预测及分析。选择长度为21nt、reads数量＞10的vsiRNA序列进行GO和KEGG富集分析，结果表明，5个品种ASSVd的small RNA预测得到的靶基因涉及到肌醇五磷酸二激酶的活性、过氧化物酶体组织有关、葡萄糖-6-磷酸异构酶活性、木葡聚糖转移酶的活性、延伸相关的全酶复合体、焦磷酸硫胺素结合、糖衍生物结合等广泛的生物学过程和分子功能;主要涉及代谢途径、RNA转运、核糖体组分、mRNA监测途径、植物-病原体互作等途径。
4、不同品种苹果ASSVd分子变异分析。选择ASSVd侵染后的富士、斗南、王林、中秋王、金冠、信浓红、信浓黄品种，对ASSVd全基因组序列进行扩增和分子克隆，然后进行序列分析。我们共获得210个ASSVd的全长序列，共计17种分离物，大小为325-333nt。我们根据nt1-4、221、251、284、302这8个位点的碱基变异，将17种分离物分为6种类型，分别为:1:nt1-4(GGTA)+nt41-46(TAAAAT)+nt221(T)+nt251(T)+nt284(G)+nt302(T);2:nt1-3(GGT)+nt41-46(AGATAX)+nt221(T)+nt251(X)+nt284(A)+nt302(A);3:nt1-3(GGT)+nt41-46(AGATAX)+nt221(X)+nt251(X)+nt284(A)+nt302(A);4:nt1-3(GGT)+nt42-47(AGATAX)+nt221(T)+nt251(T)+nt284(A)+nt302(A);5:nt1-4(GGTA)+nt41-46(TAAAAT)+nt222(X)+nt251(G)+nt284(G)+nt302(T);6:nt1-4(GGTA)+nt1-46(TAAAAT)+nt221(T)+nt251(G)+nt284(G)+nt302(T)。X:表示缺失。富士品种包含6种类型，以碱基类型4为主(47.5％);王林品种包含3种类型，以碱基类型5为主(43％);金冠包含3种类型，以碱基类型4为主(60％);斗南品种为碱基类型5，占比100％;中秋王品种为碱基类型4，占比100％;信浓红包含两种类型，以碱基类型1为主(83.3％);信浓黄包含3种类型，以碱基类型1为主(62.5％)。我们进一步将保定地区获得的17种分离物与其他已发表代表性分离物进行分析，结果表明，保定分离物可以分为三组，组Ⅰ同已报道的保定富士分离物（KR264032.1）和北京富士分离物亲缘关系较近(HQ840722.1);组Ⅱ同已报道的印度樱桃上的分离物(FN669529.1)及朝鲜苹果分离物(EU825613.1)亲缘关系最近;组Ⅲ同已报道的希腊野生苹果上的分离物(FJ974099.1)及新疆红富士苹果上的分离物(EU031455.1)亲缘关系最近。未发现ASSVd具有明显的地区专化性和品种专化性。