(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇对类风湿关节炎骨破坏的作用机制研究

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目的:1.获取并培养24h新生大鼠的骨髓细胞,观察LLDT-8对不同时间段骨髓细胞凋亡的影响。2.骨髓细胞加诱导剂诱导的同时加入LLDT-8干预,共培养72h后将细胞爬片进行HE染色和VEGF免疫组化染色,比较LLDT-8不同浓度对VEGF分泌的影响。3.新生大鼠骨髓细胞用RANKL和M-CSF诱导后加入LLDT-8干预,大鼠骨髓细胞于24h,48h,72h,14d四个不同时间段进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色后显微镜下对Trap(+)细胞计数。4.收集RA患者的外周血、关节滑液,分离得到PBMC、SFMC,用不同浓度LLDT-8干预后,用Real-timePCR检测不同标本中RANKL、OPG、VEGF、MMP-9的分泌,检测LLDT-8对骨破坏相关因子的影响。5.RA患者的PBMC用RANKL和M-CSF诱导后加入LLDT-8干预,于诱导14d后进行TRAP染色,观察组间TRAP(+)细胞数的差别。  方法:1.将出生24h的wistar新生大鼠处死后,剥离皮肤和肌肉等软组织,取肱骨和股骨,剪除长骨两端的软骨,暴露骨髓腔,取注射针头反复冲洗骨髓腔直至颜色发白得到骨髓细胞,加入RANKL和M-CSF诱导,同时加不同浓度LLDT-8干预,以MTX为药物对照组,放置37℃、5%CO2恒温箱中分别培养24h、48h、72h后取细胞行AnnexinV/PI凋亡检测,观察LLDT-8对骨髓细胞凋亡的影响。2.得到大鼠骨髓细胞后平铺于24孔板中的载玻片上,加入RANKL和M-CSF诱导,同时加入不同浓度LLDT-8干预,以MTX为药物对照组,37℃恒温培养72h后,取出细胞爬片,先于4%PFA浸泡,待固定后制蜡模,进行VEGF免疫组化染色,比较LLDT-8对VEGF表达的影响。3.将获得的大鼠骨髓细胞用RANKL和M-CSF诱导向破骨样细胞转化,同时加入LLDT-8不同浓度干预,以MTX为阳性对照组,分别培养24h、48h、72h和14d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色,红染者即为阳性,显微镜下进行Trap(+)细胞计数,比较不同浓度LLDT-8干扰破骨样细胞转化的程度。4.收集RA患者的外周血、关节滑液,分别得到PBMC、SFMC和,LLDT-8不同浓度组同MTX对照,分别干预细胞,37℃恒温下培养48h后用Real-timePCR检测OPG、RANKL、VEGF和MMP-9,研究LLDT-8与骨破坏相关因子之间的关系。  结果:LLDT-8抑制骨髓细胞向破骨样细胞转化,减少OC的产生;LLDT-8促进破骨样细胞的凋亡;LLDT-8抑制VEGF的表达;LLDT-8上调OPGmRNA表达,同时下调VEGF、RANKL和MMP-9的表达;LLDT-8减少PBMC向破骨样细胞的转化。  结论:LLDT-8促进破骨样细胞的凋亡,抑制OC的分化,降低RANKL/OPG比值,下调VEGF的表达,延缓骨破坏。
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