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研究背景全球每年约有1500万早产儿出生,其中超过100万患儿死于早产相关的并发症,早产是新生儿死亡的首要原因。近年来,随着围产医学和新生儿重症监护技术的不断进步,早产儿尤其是极低出生体重儿存活率显著提高,而同时早产儿相关的各种远期并发症也明显增加。在早产儿远期并发症中,支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)的发病率有逐年上升的趋势,且严重影响早产儿的预后和生活质量。目前对BPD的治疗尚缺乏有效的治疗措施,所以寻找早期干预并减轻高氧肺损伤的措施显得尤为重要。在病理上,BPD表现为肺泡、肺血管发育障碍,其发病机制与机械通气导致的高氧肺损伤、慢性炎症反应及抗氧化防御功能的损害有关。目前研究认为高氧肺损伤在BPD发病机制中发挥着重要作用。内源性气体信号分子的发现为研究肺损伤的发病机制开辟了一个新的领域。20世纪90年代研究发现气体分子硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)与一氧化氮(nitricoxide,NO)和一氧化碳(carbon monoxide,CO)有相似物理性质、生物活性,是第三种内源性气体信号分子。以往H2S的研究多集中于其毒性作用,近年来H2S的生理作用和药理作用被广泛研究,大量的动物研究证实内源性H2S参与肺动脉高压调节、肺血管结构重塑、肺间质纤维化以及油酸、香烟烟雾等所致的急性肺损伤的发生、发展过程,并发挥着一定的保护作用。在哮喘和慢性阻塞性肺疾病的临床研究中发现患者血浆H2S水平与患者病情轻重具有一定相关性。本室前期实验发现外源性h2s对新生儿大鼠高氧肺损伤有一定的保护作用。诱生型一氧化氮合酶(induciblenos,inos)在生理状态下不表达,在受到感染、高浓度氧、炎症等病理刺激后高表达于血管平滑肌细胞、肺内巨噬细胞、中性白细胞等炎症细胞胞浆中,inos催化合成大量no。no有氧自由基活性,大量存在时通过以下三种途径损害细胞:(1)活化多重级联信号,促进炎症细胞的聚集、炎症细胞因子的释放,引发炎症级联瀑布反应。(2)抑制呼吸链中多种酶类的活性及功能,影响细胞能量代谢。(3)最主要的是与氧自由基结合形成强氧化物过氧亚硝酸盐阴离子,攻击氧化生物膜和干扰细胞能量代谢。大量研究发现no参与了高氧肺损伤的发病过程,本实验通过观察外源性h2s对高氧肺损伤新生大鼠肺组织inos表达和no含量的影响,进一步探讨h2s对高氧肺损伤的保护机制,为h2s临床治疗早产儿bpd提供理论基础。实验目的通过外源性增加或减少肺组织h2s水平观察高氧肺损伤inosmrna表达、no水平以及肺组织损伤程度的变化,探讨h2s对高氧肺损伤保护作用机制。实验方法1实验动物分组和高氧肺损伤模型制作足月自然分娩无特定病原体级(sprague-dawle,sd)大鼠编号(体重、大小、健康情况相似),采用随机数字表法,随机分为4组:(1)ppg+高氧组、(2)nahs+高氧组、(3)高氧组、(4)对照组,每组20只,共80只。nahs+高氧组和ppg+高氧组分别给予腹腔注射nahs(28umol/kg)、ppg(50mg/kg),而对照组和高氧组则同时间给予200ul0.9%nacl腹腔注射(从实验第一天即开始,每天同一时间给予不同药物注射,连续注射7天)。新生sd大鼠出生后与母鼠共同置于同一鼠笼,对照组在空气中饲养,其余三组均置于自制氧箱中(60cm×50cm×30cm),氧流量(5l/min),维持氧浓度≥90%,钠石灰吸收二氧化碳和水;维持箱内温度22℃-25℃,湿度保持为65%左右。每天添加饮用水及饲料,更换垫料、钠石灰。观察母鼠活力,为避免母鼠因氧中毒导致喂养及护理能力降低影响哺乳,每天应交换母鼠哺乳。所有实验动物均被饲养在同一室内,喂养7天。四组大鼠实验过程所需的颗粒饲料和饮用水均由河南实验动物中心供应。2肺组织标本的留取7天后,给予实验大鼠腹腔注射戊巴比妥钠90mg/kg麻醉后,大鼠取仰卧位,用医用胶带将四肢展开并固定于自制的操作台上,用丝线绕过大鼠门牙固定于操作台头侧。打开腹腔,将肠管推向下方寻找并切断腹主动脉将大鼠放血处死,迅速开胸,充分暴露大鼠心脏及肺,用眼科剪小心分离,进一步清除除外肺脏的组织,用手术缝合线用力结扎右支气管,剪下右侧肺脏,右肺留作测肺干湿重比;用预先配制的4%甲醛溶液固定左肺下叶48小时,用于病理切片及he染色;左肺上叶用于制备肺组织匀浆或冻存于-80℃条件,并用检测试剂盒测定丙二醛(malondialdehyde,mda)、no含量和nos活性;用荧光定量pcr检测inosmrna的表达量。实验结果1硫化氢对高氧肺损伤的保护作用1.1实验各组新生大鼠肺组织病理学改变比较光学显微镜10×40倍镜下观察发现:对照组新生大鼠肺泡结构规整,肺泡间隔无明显炎症细胞浸润;高氧组肺组织白细胞(以中性粒细胞为主)渗出增多,肺泡隔见炎症细胞浸润并增宽,视野内局部肺泡腔内有少量红细胞渗出;nahs+高氧组肺组织白细胞渗出较高氧组明显减少,肺泡间隔变薄;ppg+高氧组肺组织内白细胞较高氧组更明显,肺泡间隔增宽,局部肺组织结构紊乱。1.2实验各组新生大鼠肺干湿重比(w/d)的比较高氧组新生大鼠肺组织干湿重比值(w/d)与空气中的对照组相比明显增大,比较有统计学意义(p<0.01)。与高氧组比较,nahs+高氧组新生大鼠肺组织w/d值明显减小(p<0.01),但仍高于对照组(p<0.01);ppg+高氧组新生大鼠肺组织w/d值则显著增高(p<0.01)。1.3实验各组新生大鼠肺组织匀浆mda含量的比较高氧组新生大鼠肺组织匀浆mda含量较对照组mda含量明显升高(p<0.01)。与高氧组比较,nahs+高氧组新生大鼠肺组织匀浆mda含量明显下降(p<0.01),但仍高于对照组(p<0.01);ppg+高氧组新生大鼠肺组织mda值则显著增高(p<0.01)。2硫化氢对高氧肺损伤肺组织inos/no的影响2.1实验各组新生大鼠肺组织中inos活性比较与对照组相比,高氧组新生大鼠肺组织中inos活性提高(p<0.01)。与高氧组大鼠相比,nahs+高氧组大鼠肺组织中inos活性则明显降低(p<0.01),但仍高于对照组(p<0.01);而ppg+高氧组新生大鼠肺组织中inos活性提高显著(p<0.01)。2.2实验各组新生大鼠肺组织匀浆no含量变化的比较与对照组相比,高氧组新生大鼠肺组织匀浆no水平升高(p<0.01)。与高氧组大鼠相比,nahs+高氧组大鼠肺组织中no含量明显降低(p<0.01),但仍高于对照组(p<0.01);而ppg+高氧组新生大鼠肺组织中no水平升高显著(p<0.01)。2.3实验各组新生大鼠肺组织中inosmrna相比表达量的比较rt-pcr检测结果显示,高氧组inosmrna的表达量明显高于对照组;与高氧组比较,nahs+高氧组肺组织inosmrna的表达明显降低(p<0.01),但仍高于对照组的表达(p<0.01);ppg+高氧组inosmrna的表达增加显著(p<0.01)。结论1.inos/no参与新生大鼠高氧肺损伤的病理过程。2.外源性硫化氢通过下调肺组织inosmrna的表达,进一步减少no的生成,从而发挥其对高氧肺损伤的保护作用。