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为了快速、准确的检测H5、H7与H9亚型禽流感病毒,本研究利用反向斑点杂交方法和微流控芯片方法对禽流感病毒进行检测,初步建立了H5、H7与H9亚型禽流感病毒微流控芯片的鉴别诊断方法,并对微流控芯片和反向斑点杂交的检测灵敏度进行了比较研究。本研究可分为三个部分:第一部分:H5、H7与H9亚型禽流感病毒HA基因的克隆与序列分析在H5与H9亚型禽流感病毒血凝素基因的保守区段内,选择设计2对引物,RT-PCR扩增后将目的片段连接到pGEM-T载体上,转化大肠杆菌感受态细胞,蓝白斑筛选,得到重组质粒pGEM-T-H5与pGEM-T-H9。重组质粒经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定,结果证实试验用毒株分别为H5与H9亚型禽流感病毒。H7亚型禽流感病毒HA片段参照Genbank上已发表的序列A/chicken/Italy/1285/2000(H7N1) (Genbank登录号: CY015014)人工合成,片段长208 bp (973~1 180 bp),片段连接到pMD18-T载体上,重组质粒命名为pMD18-T-H7。第二部分:反向斑点杂交方法的建立在H5、H7与H9亚型禽流感病毒血凝素基因的保守区段内,选择合成寡核苷酸探针与生物素标记引物。将探针通过紫外交联的方法固定在带正电荷的尼龙膜上,生物素标记引物用以扩增特异性片段。建立了能够同时扩增H5、H7与H9亚型禽流感病毒HA片段的多重RT-PCR方法,扩增产物经热变性后与探针42℃进行杂交,杂交后进行显色。出现明显的蓝紫色斑点判定为阳性,无斑点判定为阴性。对反向斑点杂交进行优化,整个杂交过程在RT-PCR后2.5 h内便可完成。该方法对H5与H9亚型禽流感病毒RNA的最低检测量分别为10 pg与1 pg;H7亚型可检测到1 pg质粒DNA。与琼脂糖凝胶电泳相比较,该方法检测灵敏度提高了10倍左右。3种亚型之间没有出现交叉反应,杂交特异性好。使用Rheonix公司的Hyb室温杂交液,整个杂交在室温下即可完成,检测灵敏度与42℃条件下相当,且背景更浅。本试验建立的反向斑点杂交方法灵敏度高、特异性好,可以实现H5、H7与H9亚型禽流感病毒的鉴别诊断。第三部分:微流控芯片快速检测H5、H7与H9亚型禽流感病毒方法的建立在反向斑点杂交方法的基础上,建立了H5、H7与H9亚型禽流感病毒微流控芯片快速检测方法。微流控芯片将核酸提取、PCR反应、杂交集成在一起,实现了禽流感病毒的快速、准确、自动化检测。采用常规方法进行验证,证实该微流控芯片方法结果可靠。整个检测5 h内即可完成,H9亚型禽流感病毒RNA的最低检测量为1 pg,H5与H7亚型的最低检测量分别为10 pg与1 pg质粒DNA,检测灵敏度与反向斑点杂交方法相当。该方法检测效率高、试剂用量少、操作简便,不需要特殊仪器设备,易于在基层推广应用,可为我国禽流感的防控提供技术支持与保障。