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目的：构建小鼠巨噬细胞RAW264.7内毒素耐受和脓毒症模型，使用iTRAQ技术分析内毒素耐受状态下与脓毒症状态下差异性蛋白的表达，探讨早期内毒素耐受机制。 方法： 1.用含10％胎牛血清的高糖型DMEM培养基（完全培养基）体外培养小鼠巨噬细胞RAW246.7，获取活力良好的细胞后，取对数期细胞，计数板计数，调浓度为5×105/ml，接种于6cm培养皿，使用随机数字法分成2组，分别为内毒素耐受组（耐受组）和脓毒症组，两组种板后均用完全培养基培养24h。 2.24h后更换培养液，耐受组用含10ng/ml LPS的完全培养基3ml，预处理细胞24h，脓毒症组用完全培养基3ml培养24h，24h后两组再次更换培养液，用含100ng/ml LPS的完全培养基刺激细胞4h、24h； 3.刺激4h后，（1）离心，取细胞沉淀，于-80℃冰箱保存，收集培养液上清，在实验过程中显微镜观察各组细胞形态变化并拍照。（2）取培养液上清液行ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-10。（3）流式细胞术检测巨噬细胞膜上CD16/32表达。（4）提取蛋白，进行iTRAQ标记，筛选出差异蛋白，然后使用生物信息学分析（GO注释、KEGG信号通路，蛋白网络互作图、韦恩图）。 4.刺激24h后，用流式细胞术检测巨噬细胞膜上CD16/32表达。 5.细胞处理及样本留取采用3次生物学重复，收集和统计数据，分析结果。 结果： 1.耐受组预处理后较脓毒症组巨噬细胞活化明显，伸出伪足，表面积变大，贴壁更紧密。 2.ELISA检测细胞因子浓度：耐受组刺激4h时细胞上清中TNF-α水平(18273.5±10154.4pg/ml)较脓毒症组(133233.7±68955.9pg/ml)明显降低，差异有统计学意义，P值<0.05，且细胞上清中IL-6水平(1549.8±399.2pg/ml)较脓毒症组(3175.8±959.0pg/ml)明显降低，差异有统计学意义，P值<0.05；但IL-10水平(351.1±184.2pg/ml)较脓毒症组(220.3±121.4pg/ml)略有升高，无统计学差别，P值>0.05。 3.流式细胞术检测巨噬细胞膜上CD16/32表达：耐受组刺激4h后细胞表面CD16/32阳性率(75.33%)较脓毒症组(49.69%)高，P<0.05；刺激24h细胞表面CD16/32阳性率(79.07%)较脓毒症组(94.27%)低，P<0.05，但与阴性对照组(54.11%)相比，脓毒症组和耐受组CD16/32均增高，P<0.05。 4.刺激4h后，用iTRAQ技术分析，两组共鉴定到4086个蛋白，而耐受组与脓毒症组的总蛋白比较，有63个显著差异表达蛋白，其中36个上调（比值>1.2），27个蛋白下调（比值<0.833）。 结果： 1.GO注释：差异蛋白的生物学过程主要参与器官组织生长发育、生物质量调节、外界刺激反应；分子功能主要是氧化还原酶激活、受体连接、DNA连接、抗氧化活性；细胞组分涉及染色质、胞外区、膜小泡、细胞质囊泡。 2.KEGG信号通路分析63个差异蛋白共获得112条信号通路，其中P<0.05的信号通路有27条，主要有TLR信号通路、NF-κB信号通路和TNF信号通路以及PPAR信号通路。 3.蛋白互作网络图中见HMGA1、HMGA2、HMGB1、HMGB2蛋白存在相互关联。 4.韦恩图中完全重叠部分共有差异蛋白35个，其中21个蛋白上调，14个蛋白下调。 结论： 1.初始10ng/ml LPS预处理24小时，随后100ng/ml LPS刺激4小时能诱导出巨噬细胞早期内毒素耐受模型。 2.在内毒素耐受早期状态时促炎因子TNF-α、IL-6表达降低，IL-10水平略有升高。 3.使用iTRAQ技术能鉴定出蛋白并进行早期内毒素耐受差异蛋白的筛选，生物信息学对这些可能与早期内毒素耐受相关的蛋白进行分析，有助于总结可能参与内毒素耐受的蛋白的功能、所在的细胞成分及蛋白间相互联系、可能相关的信号通路。