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研究目的:α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol epropionic acid,AMPA)受体的Trafficking是突触可塑性的核心机制,且其功能的异常与一些神经及精神疾病的发病相关,未来也将可能成为一些干预手段的作用靶点。本研究旨在构建AMPA受体Glu A1-GFP和Glu A2-His质粒,在HEK293T细胞中表达外源性Glu A1-2,初步研究外源性AMPA受体的功能,为研究AMPA受体的可视化做铺垫;另外探究氯胺酮是否可以直接作用于AMPA受体。研究方法:1.通过样品RNA的提取和逆转录,得到聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)反应的模板,应用PCR方法扩增目的基因,构建Glu A1-GFP和Glu A2-His质粒,经PCR和酶切鉴定正向阳性克隆。培养HEK293T细胞,将外源性目的基因转染至细胞,利用蛋白质免疫印记和细胞免疫组化技术验证Glu A1-GFP和Glu A2-His质粒的表达。2.采用膜片钳全细胞记录技术对外源性Glu A1-2 AMPA受体异聚体的功能进行初步探究,全细胞记录L型谷氨酸(10m M)诱发的兴奋性电流。给予药物氯胺酮(40μM),记录给药前后外源性AMPA受体介导的兴奋性电流,探究药物氯胺酮能否直接作用于AMPA受体。研究结果:1.成功构建了Glu A1-GFP和Glu A2-His两种质粒,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白证明了Glu A1的表达,蛋白质免疫印迹和细胞免疫组化结果验证了Glu A2-His质粒的表达。2.膜片钳全细胞记录技术成功记录了L-型谷氨酸诱发的兴奋性电流,分别提前预处理AMPA受体竞争性拮抗剂NBQX(10μM)和NMDA受体竞争性拮抗剂APV(50μM),结果证明,外源性Glu A1-2异聚体可以产生兴奋性电流且可以特异性的被NBQX所阻滞。3.给予药物氯胺酮(40μM)前后,外源性AMPA受体介导的兴奋性电流的幅值和衰减时间没有显著性的差异(n=6),说明了氯胺酮不能够直接作用于AMPA受体。结论:1.本研究成功的合成了AMPA受体Glu A1和Glu A2亚基的目的基因,构建了Glu A1-GFP和Glu A2-His质粒,且在细胞中可以正常表达。2.我们利用膜片钳全细胞记录技术,在HEK293T细胞上记录到所构建的AMPA受体介导的兴奋性电流,证实连接在外源性AMPA受体胞内羧基末端结构域(Intracellular C-terminal Domain,CTD)的大分子荧光标记蛋白不影响其离子通道的开放。3.在293T细胞中,40μM的氯胺酮不能影响诱发的AMPA受体介导的兴奋性电流,不能直接作用于AMPA受体。