高效液相色谱串联质谱法测定血浆和细胞内同型半胱氨酸

• 作 者: 纪堉彬
• 机 构: 汕头大学
• 出 处: 汕头大学
• 发表日期: 2019年1期
• 关键词: 血浆

同型半胱氨酸是人体内一种含巯基的氨基酸。高同型半胱氨酸血症与心血管疾病、骨质疏松、神经退行性病变等多种疾病有关，并被认为是心血管疾病和神经退行性疾病的独立危险因素。多年来国内外众多学者一直在研究同型半胱氨酸与各种疾病之间的关系，因此要求测定同型半胱氨酸的方法准确、灵敏、特异性强。本研究使用衍生化试剂2-氯-1-甲基喹啉四氟硼酸盐(CMQT)对同型半胱氨酸进行衍生化反应，并使用固相萃取进行样本处理,应用高效液相色谱串联质谱技术（LC-MS/MS），建立准确灵敏的生物样本中同型半胱氨酸检测方法，并将该方法用于测定人血浆与三种细胞样本中的同型半胱氨酸浓度。我们同时测定志愿者全血中5-甲基四氢叶酸的浓度，分析其与血浆同型半胱氨酸浓度的相关性。
　　主要研究内容与方法：
　　一、人血浆与细胞匀浆中同型半胱氨酸浓度的测定方法的建立：血浆与细胞匀浆液经过TCEP还原以及CMQT衍生化反应后，用固相萃取小柱进行提纯浓缩。色谱条件：AgilentEclipseC18色谱柱（2.1×50mm，1.8μm）,流动相为甲醇-0.05%甲酸溶液（15:85，v/v）。流速为0.2mL/min，柱温为40℃，进样量为2μL。质谱条件:电喷雾电离源（ESI），正离子方式检测，扫描方式为多反应监测模式（MRM）,用于定量分析的离子对同型半胱氨酸为m/z277.2→176.1，内标离子对为m/z281.0→176.1。
　　二、招募年龄20～60岁63名志愿者，使用上述LC-MS/MS法测定志愿者血浆总同型半胱氨酸浓度，培养三种细胞株，使用上述LC-MS/MS法测定细胞内同型半胱氨酸浓度。三、高效液相色谱-荧光检测法测定志愿者全血5-甲基四氢叶酸浓度。
　　四、统计分析性别间同型半胱氨酸浓度的差异，进行同型半胱氨酸浓度与5-甲基四氢叶酸浓度的相关性分析。
　　研究结果：
　　一、建立了LC-MS/MS法，检测人血浆和细胞中的同型半胱氨酸浓度。血浆样本在2~50μmol/L浓度范围内线性良好，细胞样本在3.5~70.0nmol/gprotein浓度范围内线性良好。测定血浆样本时本方法日内差变异系数小于5.3%,日间差变异系数小于4.1%。方法的回收率在92%～98%之间，回收率良好。测定细胞样本时，细胞匀浆液浓度检测下限为6fmol(色谱柱上样量)。
　　二、男性志愿者同型半胱氨酸平均浓度为11.08±4.43μmol/L（n=25），女性同型半胱氨酸平均浓度为8.16±2.38μmol/L（n=38），男性同型半胱氨酸浓度显著高于女性同型半胱氨酸浓（P=0.014）。志愿者血总同型半胱氨酸浓度与5-甲基四氢叶酸浓度呈负相关（r=0.062，P=0.05，n=62）。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）同型半胱氨酸浓度为23.9nmol/gprotein，小鼠主动脉血管平滑肌细胞(MOVAS)同型半胱氨酸浓度为57.9nmol/gprotein，小鼠神经瘤母细胞(N2a)同型半胱氨酸浓度为17.5nmol/gprotein。
　　结论：
　　一、建立高效液相质谱联用检测法，本方法灵敏度高，特异性强，准确性高，适合实验室研究及临床样本检测。
　　二、男性血浆同型半胱氨酸浓度高于女性，人体内血浆总同型半胱氨酸浓度与5-甲基四氢叶酸浓度呈负相关。