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由条形柄锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)引起的小麦条锈病,是影响我国小麦生产的重要病害之一。在病害流行年份,它可导致大规模的粮食减产,严重威胁着我国的粮食生产。目前,随着ESTs相关技术的发展与完善,从分子水平上分离小麦与条锈菌互作过程中的差异表达基因,已成为揭示小麦条锈病发病机理的重要手段。本实验以小麦品种水源11和条锈菌CY31为材料,构建了小麦经条锈菌诱导36、72、120小时的亲和SSH-cDNA文库。在差减文库构建过程中,高效的RNA提取方法成为有效利用SSH技术的基础。本研究采用Biozol试剂和QIAGEN试剂盒提取了小麦幼苗叶片的总RNA。比较发现这两种方法提取的小麦叶片总RNA均纯度高、完整性好,但Biozol试剂提取总RNA的产率是QIAGEN试剂盒的1.47倍,这对于那些需求RNA量比较大的实验,如构建小麦叶片的抑制性差减杂交文库、Northern杂交等,Biozol试剂就能充分展现出其明显的优点。文库中的1 983个阳性克隆提取质粒后测序,共得到1 707条高质量的ESTs。Cap3软件聚类后共获得787个Unigenes,包括332个Contigs和455个Singlets。功能注释和分类后,未知功能蛋白和Blastx比对后没有显著匹配的序列(nohits)占50.4%,为第一大类;与初级代谢和能量相关的基因分别占9.3%和6.5%,为第二大类;其次为与转运、植物抗病及感病、信号转导相关的基因,分别占4.6%、4.2%、4.1%;参与蛋白修饰、加工及蛋白合成、次生代谢、转录的基因分别占3.8%、3.2%、3.3%和2.9%;只有3个Unigenes与病原菌同源。对文库中的表达基因进行分析,发现小麦与条锈菌的亲和反应中同样存在所谓的抗胁迫基因,如过敏性诱导反应蛋白、苯丙氨酸氨解酶、锌指蛋白等。将本实验结果与水源11和条锈病菌CY23的非亲合SSH-cDNA文库进行比较,发现本文库中33.6%的unigenes未获得同源性匹配,远高于非亲和SSH-cDNA文库的17%,表明这些未匹配序列中相当一部分可能是病原菌表达基因。初步推测一些在亲和文库中特有表达的基因,特别是与病原菌同源的过氧化氢酶、延伸因子以及水稻同源的细胞死亡抑制蛋白等参与条锈菌与小麦的亲和互作过程。随后,根据基因功能注释结果,从文库中挑取8个ESTs,通过RT-PCR对它们的表达趋势进行了研究,发现其中6个ESTs表现较为明显的差异表达趋势。