羟基磷灰石/TiO2纳米孔材料的生物相容性评价以及羟基磷灰石作用于U87细胞的研究

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自从有了人类,人们就不断地与各种疾病作斗争,生物医用材料是人类同疾病作斗争的有效工具之一。医用无机纳米材料是当代材料学科的重要分支,其研究目的是制备出能够对生物体进行诊断、治疗、修复或替换其病损组织、器官的功能材料。目前医用无机纳米材料已成为各国科学家竞相研究和开发的热点,其中以纳米羟基磷灰石(nanohydroxyapatite,nHA)为代表。  然而由于nHA自身的一些缺陷,如机械强度不高,不能作为承重部位的硬组织修复材料植入宿主体内,直至今天nHA在生物学领域的应用研究仍面临着巨大的困难。除力学性能不高以外,nHA作用于细胞时不稳定、易团聚一直是nHA抗肿瘤研究中的主要困难之一。这是因为nHA的表面能高,比表面积大,容易在溶液中团聚从而减弱其纳米效应以及抑制肿瘤活性的能力。  本文构建以nHA为表面涂层,TiO2纳米孔涂层或TiO2纳米管阵列涂层为中间过渡层,Ti合金为基体的复合材料作为植入体用于硬组织修复,并在制备过程中引入磁场作为控制涂层中nHA晶体形貌的有效手段。nHA涂层中的nHA晶体能够嵌入TiO2涂层中的纳米孔隙,以机械锁合的方式与TiO2涂层相结合,从而与基体间的结合强度得到提高。此外本研究还将nHA作用于脑胶质瘤U87细胞,并评价nHA用于治疗胶质瘤的可行性,内容如下:  磁场下在钛合金表面电沉积制备了nHA涂层,研究表明磁场与电场之间的方向以及强度能够控制nHA涂层中晶体的形貌,当磁场垂直于电场时nHA为针状(B⊥J),磁场平行于电场时为球状(B‖J)。此外,nHA在溶液中的形核速度正比于磁场强度。因此,当磁场强度增大,nHA的尺寸变小。  采用恒电位阳极氧化法在钛合金表面制备了TiO2纳米孔涂层。在外加磁场的条件下,在TiO2涂层上电沉积形成nHA涂层,nHA与TiO2涂层中纳米孔隙间的几何形貌匹配程度影响nHA涂层与钛合金基体间的结合强度。当TiO2涂层中的孔径大约为100nm时,棒状nHA晶体与基体间的锁合更牢固,结合力更强。在模拟脑脊液的环境中,以钛合金和TiO2涂层为对比,研究了nHA/TiO2复合涂层在浸泡过程中发生的物理化学变化,并考察了在浸泡过程中复合涂层抑制钛合金中Al,V元素的析出情况。nHA/TiO2复合涂层在浸泡过程中遵循着这样的生长规律:HA形核→HA晶粒长大→HA晶粒相互团簇形成一体→涂层逐渐扩大覆盖到整个基体表面;检测浸泡后溶液中Al,V元素的浓度可知,nHA/TiO2复合涂层对于Al,V元素的析出起到了一定的抑制作用,能够进一步提高钛合金的生物相容性。  采用两步电化学阳极氧化法在钛金属表面制备了TiO2纳米管阵列(TiO2 nanotubearray, TNT)涂层,研究表明纳米管阵列的形貌受电解液中的HF浓度、氧化时间和氧化电压等参数的影响。TNT形成的机理主要受控于阳极氧化速率υelectro和溶解速率υdis在氧化过程中的动态平衡。SEM图的分析结果表明:一定浓度范围内,HF浓度的大小决定TiO2纳米管壁厚,进而影响管径;氧化时间能够决定TiO2纳米管的长度;氧化电压可以控制纳米管的管径尺寸。实验中通过模拟体液(Simulated body fluid,SBF)浸泡法制备了nHA/TNT复合涂层并研究了nHA在纳米管表面生成的过程和机理。研究发现具有晶型的TNT涂层诱导nHA生成的能力明显强于无相态的TNT涂层。沿纳米管管口生长的nHA呈絮状,其尺寸受控于管径的大小。此外,研究中还采用了磁/电场共约束法制备了nHA/TNT复合涂层,并对涂层进行了拉伸试验,结果表明复合涂层与基体间的结合强度明显高于SBF浸泡法制备的复合涂层。  采用电化学沉积法在钛合金表面制备了纳米羟基磷灰石涂层(nHA)、纳米和微米级HA/壳聚糖复合涂层(nHA/CTS,mHA/CTS),并应用XRD、SEM和FTIR对涂层的理化特性进行了表征。将人脑胶质母细胞瘤细胞系U87细胞与三种涂层共培养,并比较3种涂层诱导U87细胞凋亡的能力。通过MTT法细胞生长抑制实验检测以及电镜下膜层表面细胞形态观察,发现nHA膜层比nHA/CTS和mHA/CTS涂层能更有效的抑制U87细胞的增殖,具有明显的体外抗肿瘤作用。为了评价不同形貌的nHA对脑胶质母细胞瘤系U87细胞的作用,合成了4种不同形貌的nHA粉体,与U87细胞共培养,培养基中同时还添加了聚乙二醇(PEG),以保持nHA的稳定性。采用MTT法检测nHA对U87细胞的作用,研究表明nHA可显著抑制U87细胞增殖,针状nHA抑制肿瘤细胞的能力要强于另外3种粒子,此外,通过RT-PCR检测发现不同形貌的nHA可不同程度的下调细胞的Toll样受体4(TLR4)的表达水平,这可能是nHA具有不同生物活性的原因之一。  研究中以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和nHA作为生物降解材料制备了药物替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)的缓释系统。采用湿法化学工艺制备了球状和棒状的nHA粉末,将TMZ药物分子负载在nHA表面,再通过乳化溶剂挥发法将nHA-TMZ包裹在PLGA微球中,同时研究了微球中nHA的形貌和含量对缓释微球物化性能的影响。nHA在微球中的含量越高,微球的药物包封率越大。在体外缓释试验中,增加微球中的nHA含量能够降低突释现象,并且降低药物在缓释过程中的累计释放率。此外,nHA的形貌能够影响微球的缓释行为,包裹棒状nHA的微球缓释能力更强。将nHA-TMZ/PLGA微球作用于U87细胞以评价该缓释系统用于治疗脑胶质瘤的可行性。研究表明,缓释微球能够明显抑制U87细胞的增殖并能诱导细胞凋亡,此外缓释微球还能够降低U87细胞的侵袭能力,该缓释系统有望在将来用于临床治疗脑胶质瘤。
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