论文部分内容阅读
背景： 急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是继发于感染、创伤及休克等多种病理损伤的临床综合征，以进行性低氧血症和呼吸困难为主要临床表现。2012年柏林定义中ARDS轻、中、重度患者死亡率分别达27%、32%和45%，肺部进行性纤维增生是影响ARDS患者存活率及预后的一个重要因素。但是至今ARDS肺纤维性增生进程及其机制尚未完全阐明，且没有理想的治疗方法。因此，对ARDS肺纤维化发生机制和有效药物的研究具有非常重要的科学价值。有研究表明转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）是导致纤维化的关键因子，S mads信号传导通路在纤维化的发展进程中同样重要。同时越来越多研究显示氧化应激是肺纤维化的重要机制之一，而在ARDS的病程中，自由基尤其氧自由基等氧化应激反应对疾病发展有重要意义，如能早期促进氧自由基清除，或许可抑制肺纤维化，改善ARDS预后。 依达拉奉（edaravone,EDA）是强效自由基清除剂，在急性脑梗死患者中已广泛应用。近年来发现它对肺损伤也有保护作用。因此，我们通过构建脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导大鼠ARDS模型，从病理学、分子生物学角度探讨EDA能否通过抗氧自由基效应，在ARDS早期抑制肺纤维性增生，并阐明其可能的作用机制。 目的： 探讨EDA调控TGF-β1/S mads信号传导通路的作用机制，可进一步阐明氧化应激在ARDS早期肺纤维性增生的作用，为该领域的基础研究和临床治疗提供依据。 方法： 96只雄性SD大鼠，随机分为三组（n=32）：假手术组（S ha m组）、脂多糖组（LPS组）和脂多糖+依达拉奉组（简称EDA组），各组再分为1、7、14和28天共四个时间点，每个时间点每组8只。LPS组及EDA组经尾静脉予注射LPS5mg/kg，Sham组用同样方法给予等容量生理盐水。在注射完LPS后，EDA组即经腹腔内注入EDA6mg/kg进行干预，并用同样剂量连续给药7天。Sham组和LPS组则在相应观察时间点予等容量生理盐水腹腔注射。大鼠在各观察点腹腔注射2%戊巴比妥钠（40mg/k g）麻醉，经心脏取血后处死大鼠，测量双肺湿重，计算肺指数，留取肺组织待检。 肺组织用甲醛固定，石蜡包埋，然后行苏木素-伊红（he ma to xylin-eos ine,HE）染色，观察病理性炎症改变；Masso n染色，评估纤维性增生的分布；免疫组化观察α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscleactinproteins,α-SMA)及胶原蛋白Ⅰ（CollagenⅠ,ColⅠ）表达水平。肺组织中羟脯氨酸（hydroxyproline,HYP）含量采用碱水解法检测。采用RT-qPCR和WB法分别检测肺组织中TGF-β1mRNA、Smad3和Smad4蛋白表达水平。ELISA法测定肺组织ColⅠ,TGF-β1,TNF-α和IL6含量。用硫代巴比妥酸（TBA）法、黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）及比色法分别检测肺组织中MDA,SOD和GSH-PX的表达。 结果： 1.大鼠一般情况：Sha m组大鼠对刺激反应灵敏，活动正常，呼吸平顺，摄食、饮水正常，毛色光泽，体重逐渐增加；LPS组反应逐渐迟钝，活动减少，弓背蜷缩在笼子一角，呼吸加快、加深，摄食和饮水量减少。上述异常表现，LPS组可持续约7天，EDA组可持续约5天，随后对刺激的反应逐渐变好，体重渐渐增加，活动增多。 2.肺指数：与Sha m组相比，LPS组大鼠相应时间点肺指数明显增加；与LPS组相比，从第7天开始，EDA组大鼠肺指数有一定程度的下降，差异有统计学意义。 3.病理形态学：Sha m组大鼠肺组织结构清晰，肺泡间隔正常，无炎症细胞浸润，无充血、水肿等。与Sham组相比，LPS组肺泡间隔水肿，肺泡壁明显增厚，泡壁中可见有明显的炎性细胞浸润，部分肺泡代偿性扩张，各级支气管壁周有胶原纤维沉积，肺泡壁有局灶性的纤维性增生，未见有弥漫性肺纤维化形成。与LPS组比较，EDA组肺组织炎症及纤维性增生的程度有不同程度的改善。 4.TGF-β1/Smads信号传导通路：与Sham组比较，LPS组大鼠肺组织TGF-β1mRNA,Smad3和Smad4蛋白表达水平，以及血清中TGF-β1蛋白表达量均有明显上升。与LPS组对比，EDA组在同时间点TGF-β1mRNA,TGF-β1,Smad3和Smad4蛋白有不同程度的下降。 5.炎性因子表达：LPS组和EDA组大鼠血清中TNF-α,IL-6含量在第1天就有明显上升，之后又逐渐降低。与同时间点Sham组比较，LPS组TNF-α,IL-6含量均明显增加；与LPS组相比，EDA组TNF-α,IL-6含量有明显减少。 6.氧化应激反应标志物：LPS组和EDA组大鼠在1天后，肺组织MDA含量均明显升高，以第7天含量最高，之后又逐渐降低。与同时间点的Sham组比较，LPS组大鼠肺组织MDA含量明显增加；EDA组与同时间点的LPS组相比，大鼠肺组织中MDA含量明显减少。与Sham组比较，两种抗氧化物质（SOD,GSH-PX）在第1天开始就明显下降，LPS组SOD逐渐降低，GSH-PX在第7天降至最低，然后逐渐恢复；与LPS组相比，EDA在相同时间点SOD,GSH-PX含量均明显降低。 结论： 在ARDS大鼠模型中，依达拉奉能有效地抑制ARDS肺部炎症及早期的纤维性增生反应，其可能的机制为通过抗氧自由基效应，改善机体炎症反应，从而抑制TGF-β1/Smads信号传导通路，继而减轻肺组织的纤维性增生。