论文部分内容阅读
在微生物体内，安莎类化合物的合成起始于3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)，然后在I型聚酮合酶的作用下，以乙酸盐和丙酸盐为单位进行脂肪链的延长，最后经环化、修饰形成不同的安莎类化合物。
AHBA的生物合成途径与莽草酸生物合成途径相似，但又有所不同。其不同点在于在AHBA合成过程中有一个氨基的引入，最近的研究认为，AHBA合酶负责氨基引入，它是一种双功能酶，同时具有氨基转移酶活性和AHBA合酶(脱水和脱氧)的活性。因此AHBA合酶是AHBA生物合成途径中所特有的一个不可或缺的酶，也是整个安莎类化合物生物合成系统中的一个标志性的酶。迄今为止，除了安莎类化合物以外已知丝裂霉素C的生物合成也起源于AHBA。本课题主要探讨了以AHBA合酶基因和其它相关基因为靶标，通过PCR手段从放线菌中筛选AHBA阳性菌株，从中获得安莎类或与AHBA合成相关化合物产生菌的可行性。
首先根据AHBA合酶的两个保守区设计了一对简并引物(755a和755b)，初步验证利用此引物只能在已知安莎类化合物产生菌中特异性地扩增755bp左右的DNA片段。然后利用该引物对2000株放线菌中的基因组DNA进行了高通量PCR筛选，经测序验证，最终获得了33株含有AHBA合酶基因的阳性菌株。进而我们根据安莎类化合物生物合成基因簇中AHBA合酶基因、氧化还原酶基因、磷酸化酶基因连锁(AOP基因连锁)的特点，分别设计了另外四条简并性引物，并对33株阳性菌进行了复筛。结果表明：其中的27株阳性菌株都有AOP基因连锁的特点，从而进一步说明这些菌株可能具备合成安莎类化合物的潜力。
为进一步研究这些AHBA阳性菌株的背景、来源和特性，我们对33株阳性菌进行了初步的分类鉴定以及发酵培养基的优化和产物生物活性的测定(包括抗菌、抗肿瘤以及抗病毒)，从而为下一步的分离纯化和结构鉴定工作奠定了基础。将所获得的33个基因与功能已知的AHBA合酶基因进行了多序列比对和进化树分析。结果表明进化树大致形成了三个明显的分支，即萘安莎类和苯安莎类AHBA合酶基因分别位于两个不同的分支，而用于非安莎类生物合成的AHBA合酶基因则处于一个单独的分支。而且参与形成相似结构化合物的AHBA合酶基因在进化树中也比较相近。因此AHBA合酶基因序列中的进化信息有可能用于分析预测AHBA来源的化合物的结构。
为了验证上述设想，我们选定了六株AHBA阳性菌株(编号分别为4-4、3-57、22-24、22-187、192、4353)，对其发酵产物进行了分离纯化和结构鉴定。从菌株4-4和3-57中检测到了格尔德霉素(苯安莎类)，从菌株192和22-187中检测到了利福霉素B和利福霉素SV；至于菌株22-24，我们目前只分离得到了尼日利亚菌素(非安莎类)，但是已有文献报道：该类型的菌株除了产尼日利亚菌素外还产生少量的除草霉素(与格尔德霉素结构类似的安莎类化合物)，因此该菌株中的AHBA合酶基因可能用于除草霉素的生物合成。
本研究初步证明利用PCR AHBA合成基因从放线菌筛选与之相关化合物产生菌的可行性，同时也验证了AHBA合酶基因的序列分析在推测相应安莎类化合物结构方面的作用；从而为寻找新的安莎类以及AHBA相关化合物产生菌开辟了一条新的途径。
利用单基因交换阻断技术研究了4353和4088的AHBA合酶基因与产物的相关性，结果表明，4353变株丧失了产生放线菌素D的能力，而4088变株产生了原株中未见到的抗菌活性代谢产物，这些结果一方面提示，基因阻断技术尚需改进，另一方面也说明AHBA合成机制及微生物代谢的复杂性，需要我们付出更多的努力，才能完善利用基因探针筛选与AHBA相关代谢物产生菌的准确定位。