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目的：观察扶正中药黄芪和祛邪中药白花蛇舌草对basal-like型乳腺癌细胞株MDA-MB-468增殖的影响,并从p53/MDM2信号通路探讨扶正祛邪中药影响MDA-MB-468细胞增殖的机制。
方法：用黄芪注射液(Astragalus injection,AI)和白花蛇舌草注射液(Hedyotis diffusa Willd injection,HDWI)干预MDA-MB-468细胞和原代培养的小鼠骨髓基质干细胞(murine bone marrow stromal stem cells,mMSCs),相差倒置显微镜观察细胞形态,透射电子显微镜观察细胞超微结构。MTT法检测中药对MDA-MB-468细胞和mMSCs增殖的影响,CCK-8法检测中药与MDA-MB-468细胞增殖的时效关系,流式细胞术检测中药对细胞周期和细胞凋亡的影响。
实时荧光定量PCR(Real time Quantitative PCR)法检测中药作用2d后MDA-MB-468细胞p53、MDM2、EGFR、PIP、PI3K、Akt1、Akt2和PTEN基因mRNA的表达。Sanger双脱氧链终止法检测中药干预后p53基因序列。用SiRNA干扰技术沉默MDA-MB-468细胞PTEN基因的表达,MTT法检测PTEN基因沉默后中药对MDA-MB-468细胞增殖的影响,In-cell Western法检测PTEN基因沉默前后中药对MDA-MB-468细胞EGFR、Akt、MDM2、p53蛋白表达的影响。
结果: MTT法提示高浓度黄芪注射液(HCAI)和低浓度黄芪注射液(LCAI)均可明显抑制MDA-MB-468细胞增殖,且合用Tarceva时,对细胞增殖的抑制作用增强；HDWI可明显抑制MDA-MB-468细胞增殖,其抑制作用与顺铂相当,明显强于Tarceva。HCAI和Tarceva合用能明显促进mMSCs的增殖,而HDWI明显抑制mMSCs增殖,HDWI及其与LCAI、Tarceva合用对mMSCs增殖的抑制作用均明显强于单用Tarceva组。当HDWI组及LCAI&HDWI组和Tarceva合用后,对mMSCs增殖的抑制作用明显不及Cisplatin组。CCK-8法提示HCAI组和HDWI组对MDA-MB-468细胞增殖的抑制作用具有时间依赖性。HCAI、LCAI和HDWI都能不同程度的延长细胞的GO-G1期、降低S期的比例,HCAI和LCAI组对细胞凋亡有抑制作用。实时荧光定量PCR检测提示：与Control组相比,Tarceva组能明显上调MDA-MB-468细胞p53和EGFR基因表达,下调PIP基因的表达；HCAI组能明显上调PTEN基因表达,下调p53、MDM2和PIP基因的表达；而HCAI&T组能明显上调MDM2和Akt1基因的表达；HDWI能明显上调PTEN、EGFR、PI3K基因的表达,下调p53、MDM2、PIP、Akt1和Akt2基因的表达；HCAI&T组和单用HCAI相比,能明显上调EGFR、MDM2和Akt1基因的表达,上调Akt2基因的表达；与单用HDWI相比,HDWI&T能明显上调P13K、Akt1和Akt2基因的表达,下调PTEN基因的表达。Sanger双脱氧链终止法提示用药后p53在273号密码子上的点突变未发生变化。
In-cell Western法检测提示：与Control组相比,HCAI组在作用1h内显著下调p53蛋白的表达,但之后对p53蛋白无显著影响；HDWI在作用15min、30min时对p53蛋白的表达没有影响,但在给药1h、2h、1d、2d能明显下调p53蛋白的表达；HCAI组和HDWI组均在给药15min、30min和2d时明显下调p-Akt蛋白的表达；HCAI组对EGFR和MDM2蛋白的表达没有影响,但和Tarceva合用后,能显著下调EGFR和MDM2蛋白的表达。HDWI组能显著下调EGFR和MDM2蛋白的表达。与T组相比,HCAI组在给药15min、2h和1d时显著上调p53蛋白的表达,HDWI组在给药15min和2h时显著上调p53蛋白的表达；HCAI组在给药15min时明显下调P-Akt蛋白的表达；HDWI组在给药1h内及给药2d时明显下调p-Akt蛋白的表达；HCAI组能上调MDM2蛋白的表达,而HDWI组和HDWI&T组均能明显下调EGFR和MDM2蛋白的表达。
PTEN基因沉默后,和Control组相比,Tarceva和AI对细胞增殖无明显影响,但和HDWI合用后,对细胞有明显的增殖抑制作用；与Tarceva组相比,HCAI组和HCAI&T组能显著促进MDA-MB-468细胞增殖；和单用HDWI相比,HDWI&T和LCAI&HDWI&T组均能增强HDWI抑制细胞增殖的作用。与Cisplatin组相比,各组对细胞的增殖抑制作用均不及顺铂。In-cell Western法检测提示,AI对MDM2蛋白的表达没有影响,但对p53、p-Akt和EGFR蛋白的表达均有明显的下调作用。HDWI对p53、p-Akt、MDM2和EGFR蛋白的表达均有明显的下调作用。比较PTEN基因沉默前后扶正祛邪中药对p53、p-Akt、MDM2和EGFR蛋白下调比例的影响,发现PTEN基因沉默后,HCAI组对p-Akt蛋白的下调比例下降,对p53、EGFR和MDM2蛋白下调比例上升；HCAI&T组对p-Akt和MDM2蛋白的下调比例下降,对p53蛋白下调比例上升,对EGFR蛋白下调比例不变；T组、HDWI组和HDWI&T组对p-Akt、p53、EGFR和MDM2蛋白下调比例均上升。
结论：
1.扶正中药黄芪和祛邪中药白花蛇舌草对basal-like乳腺癌细胞株MDA-MB-468的增殖均有明显的抑制作用,且均呈时间依赖性。黄芪和酪氨酸激酶抑制剂Tarceva合用后抑制作用明显增强；白花蛇舌草与黄芪合用后能明显增强黄芪的抑制作用,但与单用白花蛇舌草相比无明显差异。
2.黄芪能促进mMSCs的增殖,并与Tarceva具有协同作用。白花蛇舌草明显抑制mMSCs的增殖,但显著低于顺铂对mMSCs的影响。提示扶正中药黄芪兼具“祛邪”和“扶正”两方面作用,而祛邪中药白花蛇舌草则在“祛邪”的同时,尚有“伤正”之弊。
3.扶正中药黄芪抑制MDA-MB-468细胞增殖的主要机制可能为激活p53/MDM2通路的正反馈环,通过上调PTEN基因的表达,促进PIP3的D3位磷酸化,从而对PI3K起负调节作用,下调Akt的磷酸化水平,起到抑制细胞增殖的作用。这也是祛邪中药白花蛇舌草抑制MDA-MB-468细胞增殖的作用机制之一。
4.扶正祛邪中药能调节p53基因的表达量,但不能改变其点突变的性质,使突变型的p53转变为野生型的p53。
5.除p53/MDM2通路外,白花蛇舌草可能另有较为复杂的作用通路,其作用机制及其与p53/MDM2通路之间的相互影响,有待于进一步研究探讨。