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斑蝥为芫菁科昆虫南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas或黄黑小斑蝥Mylabris cichorii Linnaeus的干燥体。现代药理学研究发现,斑蝥具有良好的抗肿瘤作用,同时也有一定的肝肾毒性。本课题组将斑蝥通过光合细菌生物转化,达到了减毒增效的目的。为了探究斑蝥转化液抗肿瘤的活性物质基础,本实验室又以活性为导向对斑蝥代谢液进行提取分离,得到了一系列的单体,但是单体体外抗肿瘤活性都不强,考虑到可能是多种有效成分起协同作用产生的抗肿瘤疗效,我们尝试从中医的整理观念出发,结合组分中药的研究思路,选取以活性为导向分离得到的活性相对较强的三个单体按照其在斑蝥代谢液中的原本比例进行配比,将配比后得到的有效组分作为一个整体去研究其抗肿瘤活性,通过有效组分的抗肿瘤活性来认识斑蝥代谢液抗肿瘤活性增强的物质基础。(1)本课题组对这三个化合物进行了有机合成,本实验首先对合成的三个化合物与本实验室分离得到的化合物进行对比,判断合成的物质就是本实验室分离得到的活性相对较强的那三个单体。然后通过HPLC方法研究这三个化合物在斑蝥代谢液中的原本比例,结果显示其比例为5:1:2,将化合物按此比例进行配比得到有效组分。(2)为了探究有效组分体外抗肿瘤活性是否增强及对哪种肿瘤细胞抑制作用最好,本实验在前期的研究基础上,筛选了肺癌A549、肝癌HepG-2、乳腺癌MCF-7三个肿瘤细胞,结果显示,有效组分体外抗肿瘤活性明显增强,而且有效组分对肺癌A549细胞的增殖抑制作用最好。所以在后续的研究中我们选用肺癌模型进行体内抗肿瘤实验。(3)诱导细胞凋亡是治疗肿瘤的一个重要手段,为了探究有效组分体外抗肿瘤活性增强是否通过诱导细胞凋亡来实现的,本实验采用细胞凋亡形态学观察、AnnexinV/PI双染色法、DNA含量检测法来检测细胞凋亡及确定凋亡时期。细胞形态观察和AnnexinV/PI双染色法结果说明有效组分具有较强的诱导肺癌细胞凋亡的作用;DNA含量检测结果表明有效组分在体外通过阻断细胞周期中的G2期,从而阻止细胞增殖。(4)有效组分在体外通过诱导细胞凋亡对肺癌细胞具有很强的抑制作用,为了进一步研究有效组分的安全性及为后续体内抗肿瘤实验的给药剂量提供可靠的实验依据,本实验进行了有效组分对小鼠急性毒性实验,采用半数致死量试验方法测定小鼠对有效组分的急性毒性反应和LD50。结果发现有效组分的LD50=214mg/kg。本实验室前期的研究发现斑蝥水提液的LD50=206mg/kg,而文献报道的斑蝥主要有效成分斑蝥素的LD50=1.86mg/kg,这说明有效组分的毒性与斑蝥素的毒性相比降低了115倍,而且有效组分的毒性比斑蝥水提液本身的毒性还低。(5)建立小鼠Lewis肺癌腹水瘤和实体瘤模型,研究有效组分体内抗肿瘤活性。实验通过测定腹水瘤小鼠体内的腹水量和实体瘤小鼠腋下瘤块的大小,发现有效组分对小鼠腹水瘤和实体瘤都有一定的治疗作用,并且有效组分低剂量组、中剂量组对小鼠腹水瘤和实体瘤的治疗作用相对较高剂量组好;实验还对小鼠免疫器官及血清中免疫因子进行了测定,发现有效组分能够提高小鼠的免疫力。据此我们得知有效组分具有体内抗肿瘤活性,并且体内抗肿瘤活性可能与它增强小鼠免疫力有关。结论:化合物通过配比后体内外抗肿瘤活性都增强,毒性相对降低。据此,我们推测有效组分可能是斑蝥代谢液抗肿瘤活性的重要物质基础之一。