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手足口病是一种常常能够引起患儿发热并轻度出疹的儿科常见病,是全球公共卫生关注的热点问题之一。近年来手足口病呈频繁暴发流行的态势,成为严重危害儿童健康的重要疾患之一。肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)是其主要的两个致病因子。被CA16所感染的患者多数症状轻微,预后良好。然而,EV71除了能够引起较为普通的手足口病症状外,还能引起各种神经系统并发症,如无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹等严重并发症,甚至心肌炎、肺水肿或肺出血,导致死亡。因此对其进行深入的研究相当必要和紧迫。VP4是EV71的外壳蛋白之一,它和VP1、VP2、VP3共同构成了病毒的外壳,不同的是,VP1、VP2和VP3位于病毒外壳的外表面,而VP4则位于病毒外壳的内表面,目前对于EV71的研究主要集中在VP1上,而对于VP4的研究则鲜有报道,其具体功能尚不明确,可能与病毒基因组RNA穿过细胞膜进入细胞内有关。近年来,表观遗传学作为新兴的领域倍受研究人员的广泛关注,且在病毒的研究领域逐渐受到重视。
为了弄清EV71 VP4基因变异趋势及其与临床症状之间的关系、EV71 VP4蛋白的抗原性及其与CA16 VP4蛋白是否存在交叉性反应,我们做了此项研究并试图从表观遗传学的角度对EV71的致病机理进行探索。本研究选择分离自2007年～2009年因手足口病来首都儿科研究所附属儿童医院就医的10例患儿的EV71毒株进行相关研究,10株毒株的编号分别为BJ25、BJ47、BJ4243、BJ65、B J67、BJ97、BJ110B、BJ110Y、BJ366和BJ374,其中BJ25、BJ47和BJ4243为从2007年病例中分离到的毒株,B J65、BJ67、BJ97、BJ110B和BJ110Y为从2008年病例中所分离到的毒株,余下的两株则为从2009年病例中分离到的毒株,这10株毒株中编号为B J97、BJ110B、BJ110Y和BJ4243的毒株为重症病例中所分离,余下的为从轻症病例中所分离,首先对这10株毒株的VP4基因进行了克隆测序,并运用DNA-Star软件中的EditSeq和MegAlign进行分析,并将其中一株EV71 VP4基因克隆入PGEX-4T-1表达载体进行原核表达,同时还表达了一株从手足口病患儿分离到的CA16毒株的VP4蛋白,运用这两个蛋白同时对189份正常人血清和20份肠道病毒感染患者急性期血清(10份为EV71感染患者急性期血清,另10份为CA16感染患者急性期血清)中的IgG进行Western Blotting检测分析,并对26份肠道病毒感染患者急性期血清(14份为EV71感染患者急性期血清,另外12份为CA16感染患者急性期血清)中的特异性IgM也作了相应的检测分析。
同时,以GAPDH基因为内参,运用染料法在实时PCR仪上检测分析横纹肌肉瘤细胞(RD)感染EV71毒株BJ110B(重症)后PCDH9、INSR、NKX-2-5和RASSF1A基因mRNA表达水平变化,并提取EV71感染前后的细胞的DNA,经重亚硫酸盐处理后运用克隆测序的方法(BSP)检测PCDH9、INSR和NKX-2-5这三个基因启动子区及其周围甲基化水平变化,应用甲基化特异性的PCR(MSP)检测RASSF1A启动子区的甲基化水平,试图从表观遗传学的角度对EV71感染的致病机理进行初步的探索性研究。研究结果显示,这10株EV71的VP4基因核苷酸序列同源性为94.2％-100.0％,从轻症与重症患者中所分离到的毒株之间的核苷酸的同源性很高,未见到一致的差异出现,其中分离自轻症的B J67和分离自重症的BJ110Y之间的核苷酸序列完全相同,说明临床症状的轻重与VP4基因的核苷酸序列没有明显关系,三个年份之间的VP4基因的核苷酸同源性也很高,也未出现一致的差异,说明近三年所流行的毒株未出现明显的变异;依据这10株毒株的VP4基因的核苷酸序列所推导的氨基酸序列则完全相同,进化树分析表明北京这三年所流行的毒株属于C4亚型。在用原核系统表达的EV71 VP4蛋白作抗原检测189份正常人血清中特异性IgG时,抗体阳性率为38.10％,低于相应的EV71 VP1蛋白作抗原的抗体阳性率(64.55％),CA16 VP4蛋白的特异性抗体阳性率为58.20％,也低于相应的CA16 VP1的抗体阳性率(75.13％);在检测20份肠道病毒感染患者急性期血清中特异性IgG时,抗EV71 VP4蛋白的抗体阳性例数是3例,而抗相应的EV71 VP1蛋白的抗体阳性例数是19例;抗CA16VP4蛋白的阳性例数是14例,抗相应的CA16 VP1蛋白的阳性例数是20例;在用于检测26份肠道病毒感染患者急性期血清IgM时,两者皆为阴性,而相应的VP1的检测结果则与感染状况有很好的符合性。提示自然感染后病毒的VP1蛋白能够更好地引起机体的抗体产生,而可能由于VP4在病毒外壳的内侧面,引导机体产生抗体的反应更弱。RD细胞感染EV7140小时后PCDH9和NKX-2-5两个基因mRNA表达水平均出现下降,但下降幅度不大,但INSR和RASSF1A两个基因表达上调,INSR基因表达上调幅度较小,而RASSF1A基因表达上调幅度相对较大;亚硫酸盐处理后运用BSP法对PCDH9启动子区的-222bp～+268bp区域所进行的研究表明此区域在RD细胞感染EV71前后均是未甲基化的,对此基因启动子区的其他部分的研究正在进行中,运用BSP法对INSR和NKX-2-5两个基因启动子区的克隆测序尚在进行中,运用MSP法对RASSF1A启动子区的研究显示RD细胞感染EV7140小时后此基因启动区出现了去甲基化的趋势。综上所述,可以看出北京地区近三年来所流行的EV71毒株属于C4亚型,与以往所报道的大陆其他地区所流行的毒株亚型的型别相同,从EV71 VP4基因核苷酸序列来看近三年来所流行的毒株未发生明显的变异;在检测人血清中的特异性IgG时,原核系统所表达的EV71 VP4蛋白有良好的抗原性,但其在检测人群中的抗体阳性率却低于相应的抗EV71 VP1的阳性率,EV71 VP4和CA16 VP4可能没有交叉性,在检测EV71病毒急性感染期患者的血清特异性IgM时,用EV71 VP4未能检测到,这些可能与其所处的蛋白外壳的位置有关,EV71 VP4位于蛋白外壳的内表面而EV71 VP1则位于蛋白外壳的外表面;或者IgM抗体更加依赖于抗原的构象。原核表达的EV71 VP4可能不适合用于对EV71既往感染的血清学诊断,也不适合于疾病的早期病原学诊断;EV71感染RD细胞后,RD细胞的PCDH9基因启动子区的-222bp～+268bp区域的甲基化水平未受影响,RASSF1A基因的启动子区却有去甲基化的趋势,且应用实时PCR检测到RASSF1A基因的mRNA水平升高,说明EV71能够影响RD细胞的甲基化水平,值得对EV71的致病机理从表观遗传学的角度作更为深入的研究探讨。