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由于雌激素类内分泌干扰物(estrogenicendocrinedisruptingchemicals,EEDCs)的化学结构的多样性，仪器检测及传统的酶联免疫吸附测定(ELISA)无法进行高通量筛选，也无法确定被检测化合物及混合物是否具有雌激素活性，而生物检测在这类物质的高通量活性筛选及检测上具有重要应用价值。其中，表达检测系统(expressionassay)根据化合物的分子作用机理，使用不同的报告基因作为观察终点来检测能与雌激素受体结合的外源性雌激素类化合物的雌激素活性，具有高通量、快速、简便、费用低的特点。本论文的目的是构建含报告基因的稳定转染的细胞株，为建立高通量筛选EEDCs细胞表达系统打下基础。
本研究第一部分以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因建立稳定转染细胞株。首先利用本实验室已经构建的7个表达载体，采用Polybrene及钙磷共沉淀方法瞬时转染T47D细胞，然后用10-9M17β-雌二醇(E2)诱导EGFP的表达。结果：用Polybrene转染方法，转染效率高，而且在p3EREc24-TA-EGFP、p3EREc24-SV40-EGFP及pMAR-EREc38-SV40-EGFP转染的T47D细胞中具有较强的诱导荧光；而钙磷共沉淀转染方法引起大量的T47D细胞死亡。
对稳定转染，以上瞬时转染筛选的三个载体和一个含有鸡溶菌酶基因超敏感位点4(hypersensitivitysite4)的载体pBS-HS4采用Polybrene的方法进行稳定共转染。结果得到了372株稳定转染细胞株，其中17株在扩大培养中丢失。对存活的355个细胞克隆株用10-9ME2进行诱导，在倒置荧光显微镜下多个细胞株能观察到有较明显EGFP表达，诱导倍数在2倍以上的细胞克隆株有26株。扩大培养初步筛选得到的26个克隆株，并用10-9ME2进一步筛选鉴定，结果标号为EGFP-T47D25、33、74、230号的克隆细胞株在诱导后72h及96h表现出非常强的诱导荧光，而且诱导倍数大于2，其中EGFP-T47D74号细胞株诱导倍数最大，为3.63倍。以上结果表明，筛选出的这些稳定转染重组细胞株可供进一步的研究，以建立细胞表达系统来筛选EEDCs。
第二部分以修饰型萤火虫荧光素酶(modifiedfireflyluciferase，Luc(+))为报告基因，构建表达载体，进行稳定转染以获得稳定转染细胞株。重组表达载体pGL3-Neo-3EREc24-TA的构建：以pGL3-Promoter为骨架载体，插入含3个雌激素反应元件(ERE)的重复保守核心序列片段，用合成的TATA盒替代SV40启动子，然后插入扩增得到的氨基糖苷类抗性基因(Neor)片段。该载体用Polybrene的方法瞬时转染T47D细胞，经10-9ME2诱导24h后使用荧光素酶分析系统(luciferaseassaysystem)处理样品，再用液体闪烁计数器(liquidscintillationcounter)测定化学发光的每分钟发光计数值(countperminute,CPM)。结果表明，Luc(+)的活性经10-9ME2诱导后有较高增幅，最高达8.18倍。重组表达载体pGL3-Neo-3EREc24-TA与pBS-HS4采用Polybrene方法进行稳定共转染，在800μg/mLG418选择压力下，筛选得到44株稳定转染细胞株。对存活的30株细胞株用10-9ME2进行诱导，结果只有1株细胞的诱导倍数达到2.15，其他细胞株没有显著的诱导效果。
本文得到了可用于进一步研究的以EGFP为报告基因的4个稳定转染细胞株，构建了以Luc(+)为报告基因的表达载体并建立了实际可行的检测荧光素酶活性的方法，为以后建立高通量筛选EEDCs的细胞表达系统打下坚实的基础。