【摘 要】
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基因工程技术的革命使得人类能充分的改造蛋白,使其更好的为人类服务.在该研究中我们将环形重组的IL-4(cpIL-4)与缺失天然结合区的白喉毒素(DT389)融合构建了靶向毒素DT4H,为
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基因工程技术的革命使得人类能充分的改造蛋白,使其更好的为人类服务.在该研究中我们将环形重组的IL-4(cpIL-4)与缺失天然结合区的白喉毒素(DT389)融合构建了靶向毒素DT4H,为了方便纯化,我们在其末端融合了His Tag.DT4H能在E.Coli中大量表达,并形成包涵体.它经过纯化、复性及透析后得到了纯度达90％的可溶蛋白.我们用肿瘤细胞检测了DT4H的活性,结果显示,U251高度敏感,MCF-7、HepG2及K562中度敏感,其它的一些细胞株不敏感.该细胞毒作用也在克隆形成实验中得到了验证.此外我们试探了对DT4H进行可溶性表达,发现用BL21trxB(DE3)及Origami(DE3)在20℃可实现可溶性表达,只是产量很低,但是它可以用Ni-NTA柱一次得到高纯度蛋白.鉴于DT毒素的免疫原性会对未来的临床治疗带来不便,我们利用cpIL4与突变的绿脓杆菌外毒素(PE40)构建了新的融合蛋白H404K.与DT4H相似,它也显示了相似的肿瘤谱.该融合蛋白在抗DT多克隆抗体存在的情况下仍然保留了很强的细胞毒作用,显示了很好的替代DT4H作靶向治疗的能力.为了进一步提高DT4H的肿瘤选择性,我们将DT内部的furin酶切位点置换成肿瘤特异的uPA位点,使得DT4H的活性必须在IL-4受体及uPA同时存在的情况下才能激活.体外细胞活性分析证实了我们设计的合理性.该蛋白有待于进一步在体内进行分析.
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