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研究背景:心脏骤停是现代急诊最为常见导致死亡的急症,病因众多,随着现代心肺复苏技术的进一步规范及急救网络的不断完善,在突发心脏骤停后经过心肺复苏恢复自主循环的比例较前已经得到明显的提高。但由于脑细胞对于缺氧极为敏感,许多患者在自主循环恢复后仍处于昏迷状态,所以心脏骤停后脑复苏是否成功已成为影响心肺复苏病人存活率高低的重要因素。因此,探寻有效治疗心脏骤停后诱发的缺血性大脑神经损伤的治疗方法成为现代急诊医学研究领域中十分有意义的研究方向。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)是一类非造血组织来源,同时存在多分化能力的干细胞。国内外研究表明,在体外诱导培养中,BMSCs可通过分泌营养因子并减少脑细胞凋亡从而达到挽救可逆的神经元并诱导神经功能的修复。虽然目前针对这方面的研究甚少,但现有动物实验模型结果提示骨髓间充质干细胞移植在心脏骤停后脑复苏治疗中具有广阔的应用前景。研究目的:观察外源性骨髓间充质干细胞移植对大鼠心脏骤停后NGF、Caspase-3表达的影响,以探讨BMSCs对心脏骤停后神经功能恢复可能的机制。研究方法:1、大鼠BMSCs的分离、培养及鉴定取体重100g-110g的SD大鼠,以颈椎脱臼法处死,在无菌条件下分离大鼠双下肢的股骨和胫骨,利用DMEM/F12培养液充分冲洗骨髓腔,收集骨髓液,离心后利用间充质干细胞可贴壁生长的生物学特性分离并纯化大鼠BMSCs,传代培养至第三代后,在倒置显微镜下观察BMSCs细胞形态,可见细胞形态单一,多呈纺锤状或长梭形生长,细胞彼此间紧密贴合,排列呈鱼群状或漩涡状;并利用流式细胞仪对第三代bmscs进行细胞表型检测。2、bmscs对心脏骤停后大鼠ngf、caspase-3表达的影响,以及其对脑复苏的作用取sd雄性大鼠,共18只,随机分成3组,a组:(sham组),b组:(ca组),c组:(ca+bmscs组),其中c组在复苏成功后(rosc后1h)从尾静脉注射bmscs,数量约为1×106个/ml。在实验第7天处死未死亡的大鼠,通过改良神经功能缺损评分(mnss)评价bmscs对神经功能恢复的影响,检测血清s100b蛋白水平了解其对损伤脑组织的保护作用,同时行免疫组织化学检测脑组织海马区中ngf、caspase‐3表达情况以进一步探讨骨髓间充质干细胞改善神经功能的可能机制。结果:1、大鼠bmscs的分离、培养及鉴定对大鼠bmscs进行体外分离、培养,经历8‐9天培养过程,在倒置显微镜下可见细胞形态单一,多呈纺锤状或长梭形,细胞彼此间紧密贴合,排列呈鱼群状或漩涡状,并呈集落式生长。传代至第三代后,通过流式细胞仪检测bmscs表面抗原,结果显示cd29表达阳性率为92.38%,cd90表达阳性率为99.21%,而cd45表达阳性率为0.21%,cd11b/c表达阳性率为0.18%,说明骨髓贴壁分离筛选法可作为分离、培养bmscs的可靠方法。2、通过改良mnss神经功能学评分结果显示,复苏后1d、3dca组、bmscs组评分明显高于sham组,结果具有统计学差异(p<0.05),bmscs治疗组评分明显低于ca组,结果具有统计学意义(p<0.05),第7天时bmscs组评分与sham组比较无明显差异(p>0.05)。复苏后7dca组、bmscs治疗组较sham组血清s100b水平均明显上升(p<0.05),且bmscs治疗组较ca组s100b水平有明显的下降,结果具有统计学意义(p<0.05),以上结果证明bmscs移植可以改善ca后大鼠神经功能。3、bmscs移植可增加ca大鼠ngf的表达,同时减少caspase-3的表达。结论:1、骨髓贴壁分离筛选法可作为体外分离、培养bmscs的可靠方法,而且通过此方法可高效地获取高纯度、高活性并且符合国际MSCs标准的干细胞。2、外源性BMSCs移植可促进心脏骤停后神经功能的恢复,其机制可能与其上调了NGF的表达、下调了caspase-3的表达有关。