青海地区野生动物H7N2亚型流感病毒遗传进化及致病性分析

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H7亚型流感病毒能够感染多种禽类及哺乳动物,最近几年,HPAI和LPAIH7N1、H7N2、H7N3、H7N4和H7N7病毒已经引起了至少750万家禽被扑杀,更重要的是,H7亚型流感病毒可以感染人,2002年以来在荷兰、意大利、加拿大和美国以及英国等国已经至少发生了100次人感染A型H7流感事件,表明H7亚型流感病毒具有全球公共安全风险。家禽中H7亚型流感病毒分离的日益增加和该亚型病毒造成人类疾病的能力,提示需要持续地监测H7病毒并了解其特征。2006~2009年间,我们在青海地区收集的鸟类、老鼠和鼠兔样本中分离到20株H7N2病毒。本研究对这些毒株开展了分子进化和致病性研究,以期了解H7亚型流感病毒在野生动物中的进化和对我国养殖业及公共安全的潜在威胁。   通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增了2006~2009年分离自青海野生鸟类、老鼠、鼠兔的A/Twite/Niaodaobinguan/0601/06,A/Mouse/Niaodao/0601/06,A/Pika/Xingxinghai/0601/06等20株H7N2流感病毒的8个基因片段,即PA、PB1、PB2、NS、NP、M、HA、NA基因,将其分别克隆到PMD18-T载体后进行序列测定,并将测序结果与GenBank发表的相应基因序列进行比较分析。结果表明:所克隆到的8个片段均包含相应病毒基因的完整开放阅读框架。20株H7N2病毒不论分离时间、地点和宿主的差异,各个基因同源性均高达99%以上,说明这些H7N2病毒来源于同一祖先,且病毒变异率很低。青海H7N2病毒与香港1978年分离的H7N2病毒A/dk/Hong Kong/293/1978(简称香港H7N2病毒)比较,除NS基因外,其它基因片段与青海H7N2病毒同源性均达到99%,而与青海地区H5N1病毒内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS同源性均在95%以下,说明A/dk/Hong Kong/293/1978(H7N2)病毒是青海野生动物H7N2病毒的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M基因供体,推断香港H7N2病毒以某种方式直接或者与某病毒NS基因形成重组体传播到青海地区,演化形成了青海野生动物的H7N2病毒。遗传进化分析结果显示,青海野生动物H7N2病毒与来自中国家鸡的H7N2病毒A/chicken/Hebei/1/2002在HA、NA、PA基因上分处不同分支,提示两者并无直接亲缘关系。   HA氨基酸序列分析发现,青海野生动物H7N2病毒的HA裂解位点PEIPKGR是典型的低致病性H7禽流感的分子特征,其受体位点也非常保守(183H、190E、226Q、228G),为典型禽类受体结合位点;PB2的627位、701位氨基酸表现为627E和701D,提示哺乳动物对这些毒株可能不易感;NA和NS1均无氨基酸的缺失,NS1蛋白C端4个结合细胞内支架蛋白功能的蛋白相互作用区域氨基酸位点为ESEV,是禽类来源流感的典型代表。M2蛋白中27位和31位氨基酸未显示病毒的金刚烷胺抗性。这些结果说明分离自青海野生动物的H7N2病毒是源于禽类、不易感染哺乳动物且对金刚烷胺敏感的流感病毒。   通过对来自鼠的A/Mouse/Niaodao/0601/06(MND1)、鼠兔的A/Pika/Xingxinghai/0601/06(PXXH1)和A/Pika/Garila/0601/06(Pgarila)3株H7N2病毒对鸡和小鼠的致病性分析,结果表明,3株H7N2病毒对鸡的。IVPI均低于1.2,鸡在感染病毒后未出现明显的临床症状,病毒局限在感染鸡的呼吸道和消化道复制;小鼠在感染病毒后无临床症状,未能从接种鼠各脏器检测到病毒,这些试验证明来自鼠及鼠兔的H7N2病毒对家禽和小鼠来说都是低致病性病毒。
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