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存在于细胞壁中的纤维素是自然界分布最广、含量最多的一种多糖，是植物细胞壁的主要成分，也是地球上最大量的可再生碳源物质。然而，纤维素的应用研究一直进展缓慢，纤维素酶作用天然底物的低效率和实际应用中的高成本是生物质转化和有效利用的限制性瓶颈。随着分子生物学和现代实验技术的发展和应用，已基本弄清纤维素酶催化水解纤维素的“酸／碱催化”双置换作用机制，但仍然未能解决高效降解天然结晶纤维素的问题，其中主要是忽略了纤维素分子的超分子结构即聚集态结构对其降解的影响。事实上，无定形纤维素和可溶性的纤维寡糖很容易被纤维素外切酶酶解，纤维素与淀粉的结构差异才是纤维素酶解与淀粉酶解速度不同的主要原因。
因此在自然界对纤维素的生物降解过程中，除了酶解机制以外可能还有其它因子和非酶组分破坏天然纤维的结晶结构来起始和协同酶解作用，比如文献报道的一些低分子量组分、短纤维生成因子、羟基自由基等等。在丝状真菌中已发现了一种含有植物膨胀因子Expansin类似序列的新蛋白Swollenin，可以破坏纤维素材料同时不产生还原糖。有研究表明Expansin促进植物细胞壁伸展和膨胀是因为其可以破坏纤维素的微纤维之间或纤维素和其它细胞壁多糖之间的氢键，虽然Expansin不具有纤维素酶活性，但它能够使滤纸、结晶纤维素、半纤维素等天然底物的纤维结构膨胀疏松，可以协同作用提高纤维素酶对微晶纤维素的水解程度，推测Swollenin也有同样的作用机制。相对于Expansin，SwoUenin有可以在微生物宿主中异源表达和分子改造的优势，而Expansin的研究基本建立在蛋白纯化的基础上，异源表达困难。但是对于真菌Swollenin的研究还是刚刚开始，还未有关于其在纤维素降解中的协同作用的报道。为了阐明膨胀因子的膨胀机理和在纤维素酶酶解天然结晶纤维素过程中的协同作用机制，本文以克隆的木霉Swollenin基因为研究对象，主要的实验工作和结果如下：
1．首先利用RT-PCR的方法扩增了瑞氏木霉QM9414的Swollenin基因(SWOl)的cDNA序列，经测序验证与已报道的序列一致，共1482bp，编码493个氨基酸；通过对Swollenin的保守域序列进行分析设计引物，从本实验室分离保存的拟康氏木霉S38中用RT-PCR的方法扩增了其Swollenin基因cDNA的部分序列；再利用SMART-RACE技术设计锚定引物，克隆了拟康氏木霉S38的Swollenin基因的全长cDNA：经过测序验证，该序列含有一个编码495个氨基酸残基的开放阅读框，将推测的拟康氏木霉S38的Swollenin的蛋白序列与瑞氏木霉SWO Ⅰ比对后发现同源性高达90﹪，因此其应该同属于SWO Ⅰ(SWOl)；用ProtParam软件推测了瑞氏木霉、拟康氏木霉和烟曲霉的SWO Ⅰ蛋白的理化性质，发现它们是一类非常相似的蛋白而且可能在真菌中普遍存在并起着类似的功能作用。
2.利用各种生物信息学软件，对3个已知的真菌Swollenin蛋白序列的同源性、结构域等一级结构进行了分析。结果表明其蛋白可能起始于一个典型的信号肽序列，紧连着一个与真菌纤维素酶结合域高度同源的纤维素结合域(CBD)。其后是一段Linker区连接着C末端可能的SWOⅠ催化域(CD)，其中大部分序列与糖苷水解酶45族(GH45)同源并且2/3催化域的氨基酸组成明显与植物Expansin相似。两两比较Swollenin、α-Expansin和α-Expansin大约都有25﹪的同源性。而且发现不同真菌SWOⅠ的序列之间特别是催化域(CD)高度同源，表明了各Swollenin的催化机制基本一致。经进化树和同源模建分析发现，SWOⅠ催化域的作用机制类似于Expansin，而非GH45内切酶。不同Swollenin的CBD及Linker序列的差异可能导致了其底物结合性质的微小差别；SWO Ⅰ二级结构的预测发现，其以β-折叠和c-无规则卷曲为主，特别是催化域的结构最为松散，说明SWO Ⅰ蛋白结构非常柔性。而且催化域中有2个非常保守的约170个氨基酸的纤连蛋白Ⅲ型(fibroneetin type Ⅲ，FnⅢ)重复序列，这仅在原核水解酶如纤维素酶、几丁质酶和淀粉酶中发现过。FnⅢ构成的β片层被认为能够轻松地伸展和再折叠，从而使蛋白保持了较大的柔性，这对Swollenin像Expansin那样促使微纤维的滑动是很重要，类似序列还未在真核生物的酶中发现；根据SWO Ⅰ不同的功能域分别进行了序列分析和三维同源模建，并预测二级结构和疏水性分析来验证模型的合理性；比对分析SWO Ⅰ和GH45内切酶的活性中心，由于SWO Ⅰ缺少在翻转型酸碱催化过程中的类似GH45内切酶中D10的广义酸基团，推测Swollenin可能因此而失去了水解活性。
3．由于Swollenin在木霉胞外酶系中的含量很低，异源过量表达可以为深入研究其性质机制、分子改造和体内、体外的进化研究提供技术支撑。然而来自于真菌和一些细菌的纤维素酶基因的异源表达比较困难、高效的异源表达体系稀少，因此我们将来源于瑞氏木霉QM9414和拟康氏木霉S38的Swollenin基因构建了在不同原核和真核宿主中异源表达的重组质粒，分别转化大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和瑞氏木霉，并得到重组表达菌株。经SDS电泳和WesternBlotting检测SWO I在真核宿主中可以活性表达，其中来源于瑞氏木霉和拟康氏木霉的Swol在瑞氏木霉宿主中的异源表达分泌量分别为0.62g/L和0.55g/L，是木霉自身分泌的Swo I的五百倍以上。
4．通过CM-sepharose离子交换层析和Mono-S高压液相离子交换层析从瑞氏木霉转化子的发酵液中分别提取纯化了来源于瑞氏木霉和拟康氏木霉Swol的重组表达蛋白，SDS电泳显示其分子量均为75 kDa左右，比预测的52 kDa要大。对纯化后的重组Swollenin．的活性检测表明其没有β-1，4糖苷键的水解活性，有微量的β-1，3葡聚糖和木聚糖水解活性，并在作用不溶的固体纤维素底物时不产生还原糖。
5．由于Swollenin可以膨胀棉纤维和改变纤维的结构，用扫描电子显微镜观察到纤维形状的改变。推测经Swollenin作用后可以打开纤维间的交连耦合，使其纤维素结构中的结晶区域更无序。对Swollenin在纤维素酶降解不溶的结晶纤维素底物过程中的协同作用进行了初步的研究，发现Swollenin确实能够提高纤维素酶酶解天然结晶度较高的纤维素类底物，协同度(DS)最高可达1.24。因此推测Swollenin可以从纤维素表面疏解多糖链，使真菌纤维素酶更容易进入纤维内部和接触更多的底物，同时使微纤维表面的葡聚糖对纤维素酶的攻击更为敏感，从而提高纤维素酶对天然底物的水解活性。
6．在实现与糖苷水解酶45家族具有有相同翻转型催化机制的糖苷水解酶第8家族——纤维素内切酶CelA高水平异源表达的基础上，结合蛋白质结构生物学信息，对其催化中心的相关关键氨基酸进行了系统的点突变分析。结果表明，其152位天冬氨酸(D152)突变为天冬酰胺后，CelA活性完全丧失；而第278位天冬氨酸突变后，其K<,cat>与野生型CelA相比没有降低，说明天冬氨酸152可能在CelA的酸碱催化中发挥重要作用，这与以前关于天冬氨酸278是广义碱残基的推测完全不同。此外，第215位酪氨酸突变后k<,cat>降为野生型的一半，推测其可能与定向亲核水分子有关。