论文部分内容阅读
细胞极性(cell polarity)是多种不同类型细胞的共同特征,对细胞的分化和功能有重要作用。在C.elegans中par基因家族包括par-1到par-6六种基因,除par-2以外,其余几种在C.elegans、果蝇、哺乳动物中都有同源物存在。par基因的突变会导致受精卵极性以及很多早期不对称现象消失。除此之外PAR在细胞连接、代谢和癌症方面也有重要意义。细胞命运决定因子cdc-42在该过程中也有重要作用,但这几种基因之间的相互作用还不太清楚。本文通过原位杂交、RNAi等方法在mRNA和蛋白水平对几种基因间的相互作用进行了研究。
通过构建发夹结构形成双链RNA(dsRNA)的方法和双T7启动子L4440为载体形成dsRNA的方法进行RNAi载体的构建,通过细菌喂食法进行RNAi分析,发现两种方法都可以取得较高的干扰率。保证了以后转基因虫体的RNAi分析结果。
本文对par基因在mRNA水平和蛋白水平的表达情况进行了分析。通过原位杂交检测了par基因在mRNA水平基因之间的相互作用,发现:par-1、par-2、par-3、par-5、par-6的mRNA都在卵母细胞、早期胚胎和雌雄同体成虫生殖腺中分布。其中par-2和par-4对其它几种par基因的mRNA表达起到重要的作用,par-2突变导致par-1、par-3、par-6的表达量减少;par-4突变时,par-1、par-5表达量都减少了,但par-2和par-4之间没有明显的作用。另外par-5突变的情况下,导致par-1和par-3 mRNA表达量增加。par-3突变也会导致par-2和par-5的表达量改变。par-6突变的情况下,其它几种par基因的mRNA在约256细胞的胚胎开始,分布发生改变,由原来的细胞质均匀分布变为后端的局域分御,集中在胚胎后端。暗示:par-4对par-1、par-3和par-5 mRNA的表达有促进作用;par-1、par-3与par-5相互抑制,par-1对par-2有抑制作用,par-2是.par-1表达所需。par-6抑制par-3和par-5 mRNA的表达,同时par-2对par-6又有明显的促进作用。
分析PAR-2、PAR-5和:PAR-6的GFP在C.elegans和par突变体中的分布情况,发现par-1突变的情况下PAR-2::GFP的后端皮层分布前移,而PAR-6::GFP的皮层分布消失。在par-2或者par-5突变的情况下,PAR-6的前端皮层不对称分布消失,在整个皮层中都有分布。同样par-5、par-6突变的情况下,PAR-2::GFP在皮层的不对称分布也消失了。
cdc-42原位杂交结果显示,其mRNA的分布情况与par基因的分布情况类似,也是在卵母细胞、早期胚胎和成虫生殖腺中分布。par-4对cdc-42 mRNA的表达也起到重要的作用,par-4突变的情况下,cdc-42由原来的均匀分布变为细胞外周分布。par-Ⅰ和par-5突变会导致cdc-42的表达量降低,par-2突变则会导致cdc-42的表达量增加。