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马尔尼菲青霉病是由马尔尼菲青霉感染引起的一种严重的深部真菌病，主要流行于东南亚地区，该病与HIV/AIDS的流行有高度相关性，病死率高。目前马尔尼菲青霉病的发病机制尚未明确，马尔尼菲青霉是青霉属中唯一的双相型真菌，温度是其双相型转换的唯一信号。双相型致病真菌在不同形态间转变的能力是其致病力的重要决定因素之一，缺乏这种能力的变异菌株其致病力往往减弱或消失。很多学者从控制马尔尼菲青霉细胞形态改变及双相性转换等方面入手研究其发病机制。我们前期研究运用抑制性消减杂交技术对马尔尼菲青霉酵母相与菌丝相差异表达基因进行筛选，初步筛出43个差异表达基因片段，其中一个在致病的酵母相表达显著上调的EST是Y552(GenBank登录号为EG026135)，序列分析提示该EST可能是小G蛋白RAS家族的Rsr1基因片段。Rsr1基因被誉为“出芽基因”，除参与酵母细胞出芽位点的选择，还与多种酵母细胞和丝状真菌细胞的极性生长和形态改变相关，更可能是白念珠菌入侵过程的一个毒力因子。本研究以酵母相马尔尼菲青霉为实验对象，运用RACE技术从Y552序列出发扩增马尔尼菲青霉PmRsr1基因全长cDNA序列和构建该基因的真核表达载体，旨在通过生物信息学分析揭示马尔尼菲青霉PmRsr1基因的生物学特性，为进一步的基因功能研究奠定基础。
实验目的：
利用RACE技术扩增酵母相马尔尼菲青霉PmRsr1基因全长cDNA序列，生物信息学手段分析其生物学特征及功能，同时分析该基因在马尔尼菲青霉生活史不同阶段的表达差异，并构建PmRsr1基因的真核表达载体，为该基因的功能研究奠定基础。
实验方法：
PmRsr1基因的全长cDNA序列扩增及生物信息学分析：酵母相马尔尼菲青霉获取；抽提酵母菌总RNA，运用RACE技术扩增马尔尼菲青霉PmRsr1基因的5和3末端序列，应用Sequencher软件拼接Y552 EST、5末端和3末端序列获取基因全长cDNA序列，根据RACE拼接结果设计引物，应用RT-PCR技术扩增PmRsr1基因的全长cDNA序列；应用生物信息学方法分析马尔尼菲青霉PmRsr1基因的生物学功能。
真核表达载体构建及表达蛋白鉴定：应用带有EcoRⅠ酶切位点的反向引物和带有HindⅢ的正向引物经RT-PCR扩展马尔尼菲青霉PmRsr1基因开放阅读框；扩增片段经TA克隆进pGEM-T质粒；经测序验证后双酶切，与真核表达载体pcDNA6/myc-His B连接，构建pcDNA6/myc-His B-PmRsr1；鉴定后的PmRsr1基因重组体，瞬时转染Vero细胞诱导重组蛋白的表达；SDS-PAGE电泳；Westernblot蛋白免疫印迹法检测PmRsr1蛋白表达。
Real time RT-PCR检测：酵母相、菌丝相和分生孢子相马尔尼菲青霉获取；抽提各相位的RNA；应用ABI PRISM7000 Real Time PCR扩增仪检测各相位PmRsr1基因的表达水平，β-Tubulin为内参。以2-△△CT法分析进行组间相对定量分析。组间多重对比采用方差分析(ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。
实验结果：
通过5和3RACE方法获得了马尔尼菲青霉酵母相PmRsr1基因全长cDNA序列。序列分析表明，PmRsr1基因全长cDNA为1866 bp，有一个完整的639 bp开放阅读框，编码213个氨基酸，761 bp的5-UTR区和463 bp的3-UTR区。Spidey软件分析显示PmRsr1基因组有8个外显子和7个内含子，GT/AG法则存在大多数的内含子中，除了内含子7外。经过WU-BLAST2分析，PmRsr1基因氨基酸序列与曲霉属的同源性较高，一致性也高达87％～89％，与白念珠菌和酿酒酵母的一致性分别为62％和57％。系统发育进化树分析显示，马尔尼菲青霉的Rsr1在进化地位上与曲霉属的亲缘关系最为接近。马尔尼菲青霉PmRsr1拥有小G蛋白特有的保守结构(G1～G5)和有利于蛋白锚定于细胞膜的CAAX盒。PmRsr1分子量24412.9 Da，理论等电点9.21，定位于细胞膜和内质网膜上。蛋白质二级结构和三级结构分析显示该蛋白α-螺旋的比例最高，其次是β折叠和β转角，α-螺旋和β折叠在分布区段上呈交叉分布。
采用pcDNA6/myc-His B载体构建PmRsr1开放阅读框的真核表达载体，克隆后筛选的阳性重组子经PCR、酶切、测序鉴定，读码框和插入方向完全正确。通过脂质体介导将重组体pcDNA6/myc-His B-PmRsr1瞬时转染Vero细胞，用SDS-PAGE检测其在Vero细胞中的表达，经Western blot鉴定可获得His标签蛋白的表达，说明重组体的成功构建，可以在Vero细胞内有效表达。PmRsr1基因真核表达载体的成功构建为后续PmRsr1p蛋白的纯化、功能研究奠定了基础。
Real time RT-PCR检测PmRsr1基因在马尔尼菲青霉生活史中的表达，结果显示，该基因存在于马尔尼菲青霉生活史三个阶段，以酵母相表达最高，菌丝相次之，分生孢子相最低。以分生孢子相为对照，酵母相的表达量为其2.15倍，菌丝相为1.26倍，统计学分析显示酵母相分别与菌丝相和分生孢子相之间的表达量存在差异(P＜0.01)，而菌丝相和分生孢子相之间无显著性差异(P＞0.05)。
实验结论：
利用RACE技术成功从马尔尼菲青霉的EST片段(Y552)出发首次克隆PmRsr1基因的全长cDNA序列，全长1866 bp，开放阅读框为639 bp，编码213个氨基酸。
成功构建酵母相马尔尼菲青霉PmRsr1基因的真核表达载体pcDNA6/myc-HisB-PmRsr1，经瞬时转染VeRo细胞获取高效表达，SDS-PAGE和Western blot鉴定重组体构建成功。
PmRsr1基因存在于马尔尼菲青霉生活史三个阶段，以酵母相表达量最高，菌丝相次之，分生孢子相最低。