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目的:研究蛇毒抗补体蛋白CVF试剂化冷冻干燥的工艺,冻干制品的质量标准以及将其用于制备内皮细胞炎症反应-相关纤溶凝血分子变化模型的研究。方法:将眼镜蛇毒粗毒通过阳离子交换层析、分子筛、阴离子交换层析分离纯化,获得CVF;通过碱性电泳及等电聚胶、高效液相色谱、飞行质谱进行纯度、分子量的鉴定;将纯化的CVF进行冷冻干燥的制剂研究,研究不同蛋白浓度(0.200、0.500、1.000mg/m L)、不同保护剂(单一保护剂:蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、BSA;复合保护剂:甘露醇分别与蔗糖、乳糖、海藻糖复配)、不同p H值(6.0、6.8、7.4)对CVF冷冻干燥的影响。在上述研究的基础上,初步确定合适的配方,进行稳定性试验:将CVF冻干样品在不同温度(6、25、37°C)下分别放置1、2、3Month后对纯度、蛋白回收率及活性进行检测;通过上述研究拟订出CVF冷冻干燥的制备工艺及相应的质量标准。然后采用CVF特异激活血清补体旁路途径,刺激人微血管内皮细胞产生炎症反应,通过ELISA检测多个时间点细胞培养上清中P-selectin、VWF、t-PA、PAI-1、TF、TM及NO指标水平的变化,并进一步研究吡咯烷二硫氨基甲酸、白藜芦醇对以上指标变化的干预作用。结果:眼镜蛇毒粗毒通过阳离子交换层析、分子筛、阴离子交换层析分离制备的CVF在碱性电泳及等电聚胶下均为一条带,飞行质谱分析得到其分子量为144.7KD;CVF的冷冻干燥研究表明,冻干过程中CVF的蛋白回收率和活性的保留量与CVF的浓度呈正相关;使用单一保护剂的结果表明,蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇对三种浓度CVF冷冻干燥中的蛋白量回收率及活性保留量均有保护作用,且甘露醇对活性保护的效果略优于其他三个配方;三个浓度下;BSA对中低浓度的CVF的活性具有保护作用,且与正常组相比,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);甘露醇分别与海藻糖、蔗糖、乳糖复配对冷冻干燥中CVF的蛋白回收率及活性保留量均有保护作用,在高浓度时,三个组别的蛋白量与正常组相比,具有统计学意义(P<0.05),三者间无显著差异;p H值为7.4时,三个浓度下CVF的蛋白回收率及活性保留量均高于p H值为6.0、6.8时CVF的蛋白量及活性;稳定性实验结果显示,CVF于6、25、37°C条件下放置1、2、3Mon时,甘露醇与海藻糖复合配方组对CVF有较好的保护作用。其中,不同条件下CVF的蛋白回收率无明显变化;6°C条件下放置1-3 Mon时甘露醇与蔗糖配方的CVF活性几乎无损失;25°C条件下,随着放置时间增加其活性略有降低;37°C条件下放置时,其活性降低,在3 Mon时尤为明显。根据上述CVF的分离纯化、冷冻干燥、纯度检测、蛋白回收率测定、活性测定的研究,初步确定了CVF试剂化制备工艺的小试条件及相应的质量标准;在CVF特异激活微血管内皮细胞致炎症反应的模型中,P-selectin、VWF的表达快速上调,其高峰时间为15min,而纤溶功能分子t-PA、PAI-1也随后出现持续上调表达,与凝血功能相关的组织因子TF表达水平持续上调,而血栓蛋白TM及NO的表达下降;吡咯烷二硫氨基甲酸、白藜芦醇对P-selectin、VWF、t-PA、PAI-1、TF上调表达具有抑制作用,而对TM及NO表达水平的下调具有干预作用。结论:通过本研究初步建立了切实可行的CVF试剂化制备的小试工艺,稳定性好,可控制性强,并初步拟定了相应的质量标准,能为CVF的进一步应用提供了科学依据和参考。采用CVF特异激活补体旁路刺激人微血管内皮细胞,会导致内皮细胞中纤溶凝血相关分子表达的变化,白藜芦醇对此变化具有干预作用。以上研究,这能为新药的筛选和研发提供合适的细胞模型和参考依据。