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家蚕（Bombyxmori）是鳞翅目昆虫的模式生物，起源于中国的古野桑蚕，人工驯化历史已经有5000多年。由其形成的产业曾为中国传统政治、经济和文化作出了卓越的贡献。但是，随着人造聚合纤维的发明以及中国经济结构转变和产业转型升级，中国的蚕桑丝绸产业面临了前所未有的挑战。随着越来越多物种的基因组数据被公布，在更为广泛的物种中开展功能基因组学研究已经越来越迫切。家蚕完整基因组的解析为家蚕的后基因组时代的研究打下了良好的基础，蚕丝产业已经步入了必须依靠重大技术突破和思路创新的新阶段。 近年来，基因组编辑技术，如锌指核酸酶技术(ZFNs)和TALE核酸酶技术(TALENs)，尤其是最新发展的CRISPR/Cas9基因编辑技术，带来了功能基因组研究的革新，并且基于CRISPR/Cas9技术的基因改造工具的发展速度可谓一日千里。尤其是可在一个基因的两个副本产生突变的MCR(Mutagenic Chain Reaction)技术。这类高效基因编辑技术，目前已在模式生物果蝇和非传统模式生物蚊子研究过程中取得了重要突破。本论文首次以家蚕和家蚕细胞为对象，以MCR技术为基础，初步探讨了开发家蚕转基因操作新工具的可能性。 丝胶蛋白是蚕丝表面的一类可溶蛋白，在细胞培养、化妆品、保健食品及生物材料等领域都具有重要的应用价值。随着细胞培养技术已被广泛应用于现代分子生物学和生物产业，其培养基组分的优化和替代需求日趋紧迫。血清作为目前大部分哺乳动物细胞培养的必须成分也有着其本身致命的缺陷，如支原体、病毒和朊病毒等微生物污染。而家蚕丝胶蛋白作为一种新兴的血清替代产品其应用前景广泛，但缺乏统一系统的评估，其应用的普遍性还未知。为此，首次结合细胞以及染色体形态学、细胞生理学和细胞转录组分析对丝胶蛋白替代血清培养细胞进行了综合评估。 本论文以家蚕、家蚕细胞以及丝胶蛋白为对象，初步探讨了开发在家蚕遗传操作的G0代能产生纯合基因型的精准转基因遗传工具的可能性;同时较为系统地评估了丝胶蛋白替代细胞培养基中的血清后细胞的生长状态、代谢活性、染色体倍性以及基因转录水平的表达丰度等。结果如下: 1.根据MCR转基因策略并结合无缝连接技术，将Cas9基因与识别切割靶位点的gRNAs以及标记基因连同切割靶位点附近的同源臂一起，成功构建MCR转基因载体系统。通过细胞转染、基因枪导入和显微注射将该MCR转基因载体导入家蚕DZNU-Bm-12细胞系或者家蚕卵的实验结果表明MCR转基因载体在细胞或卵中正确响应，标记基因表达活性正常。 2.通过显微注射家蚕卵导入的MCR转基因载体(pCas9-EGFP质粒)，成功地利用CRISPR/Cas9介导，将含有Cas9的基因表达盒精准替换了家蚕BmFIBH基因，并且在G0代个体中检测到替换后的纯合基因型。该精准转基因体系为功能基因组研究开拓了崭新的技术。该体系显著提高了定点转基因操作的效率并且缩短了产生纯合子的时间。目前正在尝试利用该技术导入富含重复序列的天蚕丝素基因到家蚕基因组中改良家蚕丝质。 3.首次结合细胞以及染色体形态学、细胞生理学和细胞转录组分析对三类广泛使用的哺乳动物细胞系(CHO细胞、MARC-145细胞和HeLa细胞)在丝胶蛋白替代血清的培养环境下的生长状态、细胞活性、染色体倍性以及基因表达丰度进行评估。结果表明，丝胶替代血清维持哺乳动物细胞的生长和繁殖的效果与含血清的细胞培养基相当或更好。本文不仅为丝胶蛋白替代血清培养细胞提供了确凿的实验证据，还有助于对细胞培养和丝绸产业可持续发展的理解。