Pseudomonas putida NCIMB9866分解代谢2,4-二甲基苯酚的机理研究

• 作 者: 陈燕飞
• 机 构: 中国科学院大学
• 出 处: 中国科学院大学
• 发表日期: 2013年期
• 关键词: 恶臭假单胞菌 2 4-二甲基苯酚 环境污染 微生物分解 酶促反应 分子机制

2，4-二甲基苯酚是一种重要的优先污染物。目前，微生物分解代谢2，4-二甲基苯酚的研究，主要以Pseudomonas putida NCIMB9866为对象，大多集中于从生理和生化水平上鉴定2，4-二甲基苯酚的代谢途径，以及分离、纯化和表征代谢所需的酶。关于2，4-二甲基苯酚分解代谢的分子生物学研究，特别是编码代谢反应所需酶的结构基因，却很少报道。　　
本文从分子生物学和酶学水平上，对9866菌株分解代谢2，4-二甲基苯酚相关的基因及其编码蛋白进行研究。　　
首先，我们通过转录分析，发现9866菌株4-甲基苯酚代谢中两个酶PchCF和PchA的编码基因可能也与2，4-二甲基苯酚代谢有关。然后通过基因表达、酶促反应和产物鉴定，证明了PchCF可以催化2，4-二甲基苯酚到4-羟基-3-甲基苯甲醛的反应，PchA可以催化后者进一步氧化为4-羟基-3-甲基苯甲酸。基因敲除和互补结果显示，PchCF的编码基因pchF对于2，4-二甲基苯酚是必需的，而PchA的编码基因pchA则不是必需的。虽然，9866菌株体内还存在其他与PchA功能类似的酶，但是比活结果显示，PchA在2，4-二甲基苯酚代谢中发挥的是主要作用。　　
然后，为了寻找9866菌株中与2，4-二甲基苯酚代谢相关的其他基因，我们通过构建转座子突变体文库，并获得了可能催化4-羟基间苯二甲酸到原儿茶酸的反应的酶的基因dmpA。结合基因表达、酶促反应结果，最终证实了上述代谢反应。而且，基因敲除和互补结果显示，dmpA对2，4-二甲基苯酚的代谢也是必需的。　　
最后，我们在通过基因组步移、构建突变体文库、全基因组测序寻找9866菌株中与2，4-二甲基苯酚代谢相关的基因时发现，与2，4-二甲基苯酚代谢相关的结构基因有可能分布于染色体和质粒，或者不同质粒等多个不同位置，同时，由于在2，4-二甲基苯酚相关代谢基因簇的两侧出现了编码转座酶和解离酶基因，我们推测这些基因及其编码产物可能具有不同的进化起源。