【摘 要】
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白细胞介素15(IL-15)是1994年才发现的一种能促进细胞生长和分化的细胞因子,主要由天然免疫细胞产生.它与白细胞介素2(IL-2)有相似的生物学活性,但其结构和组成与IL-2毫无相
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白细胞介素15(IL-15)是1994年才发现的一种能促进细胞生长和分化的细胞因子,主要由天然免疫细胞产生.它与白细胞介素2(IL-2)有相似的生物学活性,但其结构和组成与IL-2毫无相似之处.已有的研究表明,鸡细胞因子在功能活性方面与人类和哺乳动物的细胞因子相似,尤其是IL-2与干扰素γ(IFN-γ)均具有较强的免疫增强作用.鸡IL-15(ChIL-15)是一种新发现的且与IL-2活性相似的细胞因子,作为疫苗佐剂研究的重要候选细胞因子有巨大潜力.参考已发表的ChIL-15基因序列,设计合成引物,应用RT-PCR技术从刀豆球蛋白A(ConA)活化的白来航鸡脾淋巴细胞中克隆ChIL-15 cDNA,将其与Smal Ⅰ酶发处理的pUC19载体连接,构建重组质粒pUC19ChIL-15;用PCR技术从pUC19ChIL-15中扩增出去信号肽的成熟ChIL-15(mChIL-15)基因,与pMD 18-T载体相连构建重组质粒pMDChIL-15;然后用Kpn Ⅰ/PstⅠ双酶切下mChIL-15基因片段,定向亚克隆到经同样酶切处理的带有6个组氨酸标签的表达载体pP<,R>oEXHTa中,构建重组质粒pP<,R>oChIL-15,对其测序确认读框正确后,转入大肠杆菌DH5α中诱导表达并进行纯化,用重组ChIL-15(rChIL-15)免疫豚鼠,制备多克隆抗体;再用HindⅢ/PstⅠ从质粒pP<,R>oChIL-15上切下mChIL-15基因,定向亚克隆到经同样酶切处理的杆状病毒转移载体pMelBacB中,经酶切、PCR和序列测定鉴定后,与杆状病毒线形化DNA(Bac-N-BlueDNA)共转染Sf9昆虫细胞,经三轮蚀斑纯化,构建重组杆状病毒rBac-ChIL-15,用该重组病毒感染处于对数生长期的Sf9细胞,按不同的时间收取样品,离心后对其上清和沉淀进行SDS-PAGE和Western blot分析.结果显示,该研究所用白来航鸡IL-15 cDNA 5非编码区有两个框外ATG起始密码子,开放阅读框由564bp组成,编码187个氨基酸,其中N末端信号肽含有66个氨基酸残基,在第48、149和166位的天冬酰胺残基上有三个潜在的N-糖基化位点.mChIL-15含有4个高度保守的半胱氨酸残基,可形成两个链内二硫键.与已发表的ChIL-15基因序列相比,该序列编码区第365、397、407、457、474、556、557位的核苷酸发生了变化,分别由A、C、G、G、A、G、C依次变成了G、T、T、T、G、A、T,推导的氨基酸序列在第122、133、136、153和186位发生了改变,分别由原来的天冬氨酸、精氨酸、色氨酸、丙氨酸、丙氨酸依次变成了某氨酸、色氨酸、亮氨酸、丝氨酸和异亮氨酸,其中第474位碱基的变化是同义突变,这表明ChIL-15可能存在多态性;rChIL-15融合蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达,其分子量约为18kDa,扫描分析含量在30％左右,用离子亲和树脂对rChIL-15进行了有效的纯化,并成功制定出了豚鼠抗rChIL-15多克隆抗体;重组杆状病毒rBac-ChIL-15感染Sf9细胞后24小时已表达rChIL-15蛋白,96小时表达量达到高峰,其分子量约为55kDa,占细胞总蛋白的25％,在Western blot实验中,该重组蛋白可被豚鼠抗原核rChIL-15多克隆抗体识别.
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