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黑尾叶蝉属半翅目叶蝉科，是一种重要的水稻害虫，它不仅能刺吸取食水稻汁液造成危害，还能传播水稻矮缩病、水稻黄叶病等多种水稻病毒病，对水稻生产造成严重危害。本文克隆了黑尾叶蝉卵黄蛋白(Vg)及其受体(VgR)基因，制备了Vg多克隆和单克隆抗体，并结合生态学及分子生物学等方面的技术研究了取食感染RDV水稻对黑尾叶蝉生殖的影响，为研究黑尾叶蝉-普通矮缩病毒-水稻三者互作机制奠定基础。 1.黑尾叶蝉Vg基因的克隆与分析 以近缘昆虫Vg基因作为参考序列，通过本地blast从黑尾叶蝉转录组数据中筛选到一个Vg和若干个Vg相关基因。黑尾叶蝉Vg基因6，170bp，GenBank登录号为KX022097，开放阅读框长度6，051 bp，编码2，016个氨基酸，预测蛋白分子量约224 kDa，预测pI为7.5。1～17位氨基酸为信号肽，丝氨酸(S)占12.4％，天冬氨酸(N)占8.6％，谷氨酰胺(Q)占8.1％。结构分析发现，黑尾叶蝉Vg包含三个经典的保守区域Vitellogenin-N、未知功能域DUF1943与vWD，以及多聚丝氨酸区域、RXXR(RYAR)剪切位点、GL/ICG和DGXR及C端9个半胱氨酸残基。利用荧光定量PCR(qPCR)研究发现，黑尾叶蝉5龄若虫可检测到Vg微量转录水平，羽化后，转录水平迅速上升，羽化后12d达到最高点，随后下降。随着黑尾叶蝉产卵，转录水平再次上升。双抗夹心ELISA检测黑尾叶蝉Vg翻译水平基本与转录水平一致，但是在成虫羽化后才检测到有蛋白表达。另外，雄虫体内也检测到微量的转录水平。 2.黑尾叶蝉Vg的原核表达及单克隆抗体制备 选取黑尾叶蝉Vg基因部分序列构建重组表达载体，并在大肠杆菌Rosetta菌株中进行诱导表达。结果发现黑尾叶蝉Vg重组表达产物在包涵体中表达，蛋白大小约38 kDa，western blot结果验证条带大小正确。经8M尿素溶解，his-tag镍柱纯化，得到干净的重组表达蛋白，并制备兔多克隆抗体和鼠单克隆抗体。Western blot验证，抗体特异性较高。黑尾叶蝉卵黄蛋白粗提物经SDS-PAGE分离后，存在4条主要条带和其他2条较明显的蛋白，将这6个条带经LTQ(LC-MS/MS)分析，结果发现第一条条带为类卵黄蛋白，第2～6条条带均为黑尾叶蝉传统卵黄蛋白经不同剪切后产生的亚基。因此黑尾叶蝉卵内存在多个Vg的剪切亚基。另外，在黑尾叶蝉雄虫中也检测到微量Vg表达水平。 3.黑尾叶蝉VgR基因的克隆与分析 以近缘昆虫VgR基因作为参考序列，通过本地blast从黑尾叶蝉转录组数据中筛选到一个传统的VgR。黑尾叶蝉VgR基因cDNA全长6，676bp，GenBank登录号为KX022098，开放阅读框长度5，568 bp，编码氨基酸1，855个，预测编码蛋白大小206 kDa，pI为4.9。SignalP4.1 Server在线预测显示1-17位氨基酸为信号肽。黑尾叶蝉VgR属于低密度脂蛋白受体(Low Density Lipoprotein Receptor，LDLR)家族，具有LDLR家族典型的5大功能域:配体结合域(Ligand-binding domain，LBD)、表皮生长因子前体同源域(EGF-precursor homology domain，EGFP)、O-糖链结构域(O-linked Carbohydrate Domain)、跨膜结构域(transmembranedomain)和胞内区域(cytoplasmic domain)。多序列比对和进化树分析结果表明，黑尾叶蝉VgR与褐飞虱VgR基因最为近缘。荧光定量PCR研究发现，黑尾叶蝉VgR从5龄期启动转录，羽化后转录水平逐渐上升，至羽化后8d达到最高水平，随后下降。随着黑尾叶蝉产卵，转录水平再次上升。值得注意的是，黑尾叶蝉VgR在卵内亦有微量表达，不过在雄虫并未检测到转录水平。 4.取食感染RDV水稻对黑尾叶蝉生殖的影响 对比初羽化黑尾叶蝉在健康和感染RDV水稻TN1两种寄主上取食后单雌产卵量，发现二者无明显差异，荧光定量PCR检测各自的Vg和VgR转录水平也没有差异。而对比初羽化黑尾叶蝉在健康和感染RDV水稻秀水11两种寄主上取食后单雌产卵量，却发现取食感染RDV秀水11上单雌产卵量明显提高，约为取食健康秀水11的1.65倍。荧光定量PCR检测各自Vg和VgR转录水平，结果表明同取食健康秀水11的黑尾叶蝉相比较，取食感染RDV秀水11的黑尾叶蝉Vg和VgR转录水平均有上升，且均在羽化后4d、14d、16d、18d、20d达到差异显著水平。双抗夹心ELISA分析取食感染RDV秀水11和健康秀水11黑尾叶蝉卵黄原蛋白表达水平也发现，取食感染RDV秀水11黑尾叶蝉羽化后不同时间段卵黄原蛋白表达水平均高于取食健康秀水11黑尾叶蝉卵黄蛋白表达量，且在羽化后2d、8d、10d、12d、20d达到差异显著水平。Western blot的结果和双抗夹心ELISA的结果基本一致。另外，取食感染RDV秀水11还能快速启动卵黄蛋白的表达，从双抗夹心ELISA的结果中分析，取食感染RDV秀水11黑尾叶蝉羽化后2d能够检测到卵黄蛋白表达，而取食健康秀水11黑尾叶蝉虫体内却不能检测到。从westernblot结果中分析，取食感染RDV秀水11黑尾叶蝉羽化后4d卵黄蛋白表达量水平远远高于取食健康秀水11。