论文部分内容阅读
目的：在Wistar乳鼠进行大脑皮质神经细胞原代培养，研究谷氨酸损伤模型中头孢曲松钠对培养的神经细胞的形态、细胞活力和细胞超微结构的保护作用，以及头孢曲松钠在静息状态和谷氨酸作用诱导短暂神经细胞内钙超载状态下对神经细胞内钙离子浓度的影响，并初步探讨头孢曲松钠神经保护的作用机制。
方法：第一部分、在Wistar乳鼠进行大脑皮质神经细胞原代培养，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经特异性烯醇酶(NSE)免疫组化染色方法分别鉴定神经胶质细胞和神经元；培养的皮质神经细胞分为对照组、头孢曲松钠组、谷氨酸组、头孢曲松钠预处理组四组，甲基四偶氮唑兰(MTT)法检测各组神经细胞的细胞活性，电镜观察各组神经细胞超微结构的损伤程度，逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)检测GLT-1mRNA和EAAc1mRNA表达的变化，免疫组化方法检测GLT-1蛋白表达的变化。第二部分、培养的皮质神经细胞分为对照组、头孢曲松钠组两组，运用激光共聚焦扫描显微镜观察静息状态下未/给予谷氨酸损伤后各组神经细胞内钙离子荧光强度的变化；加入谷氨酸短暂作用诱导短暂神经细胞内钙离子超载后，激光共聚焦显微镜实时观测未/给予谷氨酸损伤后以及二氢红藻氨酸(DHK)+谷氨酸作用后各组神经细胞内钙离子荧光强度的变化。
结果：第一部分、成功的分离、培养和鉴定了Wistar乳鼠大脑皮质神经细胞；MTT法检测中，对照组、头孢曲松钠组、谷氨酸组、头孢曲松钠预处理组的吸光度值分别为0.813±0.023、0.795±0.010、0.624±0.028、0.738±0.021，与对照组比较，头孢曲松钠组吸光度值降低，但无统计学意义(P>0.05)，谷氨酸组吸光度值明显降低(P<0.01)，头孢曲松钠预处理组较谷氨酸组吸光度值明显升高(P<0.01)；电镜观察显示，谷氨酸组神经细胞的超微结构明显受损，头孢曲松钠预处理组神经细胞仅核膜下染色质轻度边集，线粒体嵴型肿胀，损伤明显减轻。RT-PCR结果显示，对于EAAC1 mRNA的表达，对照组和头孢曲松钠组分别明显高于谷氨酸组和头孢曲松钠预处理组(P<0.01)，但对照组与头孢曲松钠组、谷氨酸组与头孢曲松钠预处理组之间的差别无统计学意义(P>0.05)；对于GLT-1mRNA的表达，头孢曲松钠组明显高于其他各组，谷氨酸组明显低于其他各组，头孢曲松钠预处理组高于谷氨酸组(均P<0.01)；GLT-1蛋白免疫反应阳性细胞数，头孢曲松钠组较对照组增加，谷氨酸组较对照组减少，头孢曲松钠预处理组较谷氨酸组增加(均P<0.01)。第二部分、静息状态下，未给予谷氨酸时，对照组、头孢曲松钠组细胞内钙离子平均荧光强度分别为141.257±6.165、127.329±12.086，两组之间的差别无统计学意义(P>0.05)；给予谷氨酸损伤后，对照组、头孢曲松钠组细胞内钙离子平均荧光强度分别为281.400±21.378、220.17l±24.061，对照组明显高于头孢曲松钠组(P<0.01)。谷氨酸短暂作用诱导短暂细胞内钙超载后，未给予谷氨酸时，对照组、头孢曲松钠组细胞内钙离子平均荧光强度迅速上升后下降、恢复到静息水平，且头孢曲松钠组较对照组上升缓慢且恢复迅速；给予谷氨酸损伤后，对照组、头孢曲松钠组细胞内钙离子平均荧光强度迅速上升后始终保持明显高于静息状态水平；短暂谷氨酸作用之前加入DHK后，对照组、头孢曲松钠组两组中细胞内钙离子荧光强度较未加DHK之前上升幅度增加，但下降阶段明显消失，始终保持明显高于静息状态水平。
结论：第一部分、谷氨酸作用于培养的大鼠脑皮质神经细胞可以造成神经细胞损伤，使神经细胞存活数量减少、细胞活力降低，细胞的超微结构受损；头孢曲松钠预处理可以减轻谷氨酸对培养的神经细胞的上述损伤，产生神经保护作用；头孢曲松钠在抵抗谷氨酸细胞毒性、产生神经保护作用中伴随GLT-1mRNA和蛋白表达的上调，推测头孢曲松钠是通过上调GLT-1的表达来发挥神经保护作用的。第二部分、静息状态下，单纯头孢曲松钠作用不引起细胞内钙离子浓度的改变，谷氨酸损伤后可导致了细胞内钙离子超载，而头孢曲松钠预处理能减轻谷氨酸的上述作用；谷氨酸短暂作用可以引起短暂的细胞内钙离子超载，谷氨酸损伤可以使细胞恢复静息状态细胞内钙的能力受到损害，头孢曲松钠可抵抗谷氨酸的上述作用；应用GLT-1拮抗剂DHK可以消除头孢曲松钠对谷氨酸引起的细胞内钙离子超载的抵抗作用。