毛果杨PtrDLT和PtrWOX4基因在微管形成层发育中的功能解析

• 作 者: 毛昱力
• 机 构: 东北林业大学
• 出 处: 东北林业大学
• 发表日期: 2020年期
• 关键词: 毛果杨

木材是地球上含量丰富的可再生资源，是重要的工业原材料。木材的形成主要依赖于木本植物中维管形成层的活动。维管形成层通过不断向内分裂分化，进而产生次生木质部，即木材。该发育过程受到很多遗传和其他内源因子的调控，其中转录因子发挥着极其关键的调控作用。本研究解析了毛果杨（Populus trichocarpa）形成层特异表达转录因子基因DWARF AND LOW-TILLERING(DLT)和WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX4（WOX4）的调控功能，为揭示木本植物维管形成层的发育提供了新线索。
　　本研究首先对PtrDLT和PtrWOX4进行基因克隆，用于解析其在毛果杨形成层发育过程中的功能。通过基因蛋白序列比对分析发现，毛果杨基因组上存在两个DLT基因PtrDLT-A和PtrDLT-B，蛋白序列同源性高达94.1％;也存在两个WOX4基因PtrWOX4-A和PtrWOX4-B，蛋白序列同源性高达97.2％，预示这两对基因可能分别存在功能冗余。根据基因序列分析结果进行gRNA的设计，分别构建pEgP237的PtrDLT-A和PtrDLT-B基因双突变CRISPR载体以及PtrWOX4-A和PtrWOX4-B基因双突变CRISPR载体。通过农杆菌介导的快速遗传转化法对毛果杨进行遗传转化，分别获得PtrDLT-A和PtrDLT-B两个基因共同敲除突变体株系，PtrWOX4-A和PtrWOX4-B两个基因共同敲除突变体株系。表型分析结果表明，PtrDLT基因突变后导致植株的树高低于野生型植株，地径和茎节数小于野生型植株。组织细胞学分析结果显示，相比于野生型，PtrDLT基因突变使木质部中纤维细胞排列紧密，射线细胞横截面宽。PtrWOX4基因突变后导致植株呈现出矮小、茎干纤细、叶片狭小的特点，同时突变体植株后期停止生长，顶芽和根部发育不良，植株顶端优势破坏，底部生长出大量侧枝。组织细胞学分析结果显示，PtrWOX4基因突变显著影响形成层发育，导致木质部分化紊乱，细胞壁变薄。
　　本研究对突变体及野生型毛果杨进行转录组(RNA-seq)分析，结果发现PtrDLT基因突变影响少数几个形成层功能相关基因，但木质部中几乎全部下调细胞壁合成酶相关基因，这表明PtrDLT基因的缺失对木质部发育产生影响。PtrWOX4基因突变导致大量形成层特异表达基因的转录发生改变，同时也影响大量形成层相关功能基因，表明PtrWOX4基因是调控维管形成层发育的关键基因。此外，研究发现PtrWOX4基因突变也影响顶端分生组织的部分干细胞相关基因的表达，表明PtrWOX4基因还参与顶端分生组织发育。
　　综上所述，毛果杨PtrDLT基因参与调控木质部分化，但对维管形成层发育影响较小;毛果杨PtrWOX4基因是调控维管形成层发育的关键基因，同时参与调控顶端分生组织发育，这些研究结果为后续精细调控机制的深入研究奠定了基础。