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ECF(Extracytoplasmic function)σ因子是一类重要的与环境压力相关的转录因子,属于σ70家族ECFσ亚族。它通过膜上与之相互作用的anti-σ因子感知环境信号的变化,指导RNA聚合酶从转录水平上实现对环境的适应性调控。腾冲嗜热厌氧杆菌(T.tengcongensis)是我国自主分离并完成全基因组序列测定的第一个原核微生物。基因组信息显示该菌中有7个可能的ECFσ因子,据认为与其环境适应性密切相关。本论文开展了对这7个ECFσ因子(以TtRpoE命名)以及其相应的anti-sigma因子的研究,发现其中一个因子TtRpoE1与高温环境适应性相关,并通过与其自身启动子之间的互作确定了TtRpoE1启动子序列,初步预测了其可能的调控元,揭示了其启动子识别特异性与其生理功能之间的关系。
对7个ECFσ因子所在基因簇的分析发现除TtRpoE6及TtRpoE7外,其它五个因子相邻的下游基因均有跨膜结构域。我们利用酵母双杂交筛选到其中四个因子的anti-sigma因子,均为其下游紧邻的蛋白,它们通过N端结构域与相应的ECFσ因子相互作用。利用引物延伸实验确定了TtRpoE1及TtRpoE7两个因子的转录起始位点,为进一步确定它们的调控元奠定了基础。
通过对TtRpoE1与其自身启动子之间相互作用的研究,发现与σ70家族具有四个结构域的持家σ因子不同,仅具有两个保守结构域的ECFσ因子TtRpoE1结合双链结构的启动子DNA较弱,而更易于结合具fork-junction结构的启动子DNA；其anti-sigma因子TolB不能阻止TtRpoE1与启动子之间的结合但它们可以形成更大的复合物。通过-35及-10区域的碱基扫描突变确定了TtRpoE1特异的启动子序列,它主要通过识别并结合-35及-10区域邻近位置的特异保守碱基以区别持家σ因子的启动子,从而实现压力条件下对相关基因的调控。
利用序列一致性分析初步确定了TtTpoE1基因的调控元,热激实验表明TtRpoE1主要调控高温环境下的适应性。80℃条件下TtRpoE1和TolB的转录量有所提高但不显著,蛋白水平的检测结果显示TolB的量随着热激时间的延长明显降低。推测热激条件下TolB可被其它水解酶降解,以释放TtRpoE1起始热激条件下相关基因的转录。通过对TtRpoE1调控元基因热激条件下的转录分析,结果显示这些与膜功能相关基因的转录水平在80℃条件下均呈2-3倍的提高,可能有利于细菌应对高温造成的细胞膜压力。
另外,本论文还通过酵母双杂交的方法,以复制起始蛋白TtDnaA为诱饵蛋白对腾冲嗜热厌氧杆菌91个转录因子进行了筛选,找到了与之特异互作的转录相关因子TtNusG2。随后,又通过表面等离子共振、免疫共沉淀的方法证明无论在体外还是体内这两个蛋白之间均存在互作。分别亚克隆TtDnaA的四个结构域与TtNusG2的互作结果表明,TtDnaA通过DomianⅠ和DomainⅢ与TtNusG2相互作用；亚克隆TtNusG2的两个结构域均不能与TtDnaA相互作用,说明TtNusG2蛋白是做为一个整体与TtDnaA蛋白相互作用。这是首次关于复制起始蛋白TtDnaA和转录因子TtNusG2之间互作的报道,该结果进一步拓宽了对两个蛋白功能的认识,为深入研究它们在体内的功能提供了线索。