论文部分内容阅读
第一章利用条件性敲除小鼠研究NRSF/REST在癫痫中的作用
神经元限制性沉默因子(Neuronal Restrictive Silencing Factor/RE1-silencingtranscription factor,NRSF/REST)是Cys2-His2型锌指蛋白Gli-Krüppel家族的一种负转录调控因子,通过与基因中的神经元限制性沉默元件(NeuronalRestrictive Silencing Element/Repressor element-1,NRSE/RE1)结合,调控神经递质受体、离子通道、神经营养因子等多种神经特异性基因的表达,在神经细胞分化、神经系统发育、干细胞维持过程中起着非常重要的作用。近年来,NRSF在癫痫发生过程中的作用引起人们广泛关注。与体外癫痫模型相比,动物癫痫模型更符合人类癫痫的病理生理过程。戊四氮是一种中枢神经兴奋剂,本身无神经毒性,能够促使兴奋性突触的去极化过程增强诱导癫痫模型,并具有重复性好、易操作、指标客观等特点,因此,本文中我们利用戊四氮急性致痫动物模型研究并比较了野生型小鼠和神经细胞中Nrsf基因敲除小鼠(neuron-specific Nrsfconditional knockout,Nrsf,cKO)在动物给药后第一次肌阵挛、间歇性痉挛、强直性痉挛、死亡率四种癫痫相关行为学指标上的变化,并利用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹、免疫组化等方法研究了Nrsf、脑源性神经营养因子Bdnf(BrainDerived Neurotrophic Factor)、Caspase-3等癫痫、凋亡相关基因的表达变化,最后利用高效液相色谱法分析了大脑中多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)等神经递质的变化情况。结果显示,与野生型癫痫发作小鼠相比,Nrsf cKO癫痫发作小鼠间歇性痉挛和强制性痉挛的发作时间明显延迟,发作频率明显降低,死亡率也明显降低。
我们的工作首次阐述了NRSF在小鼠个体癫痫发生过程中具有重要的生理功能。在小鼠神经细胞中敲除Nrsf基因后,戊四氮诱发的癫痫发作减轻,这可能是通过Bdnf等下游基因及癫痫相关基因的表达影响了兴奋性、抑制性神经递质系统之间的平衡关系发挥实现的。这些结果,为进一步研究Nrsf基因在癫痫中的功能提供了重要方向。
第二章利用条件性敲除小鼠研究NRSF/REST在帕金森病中的作用
1-甲基-4-苯基1,2,3,6-四氢吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetmhy-dropyridine,MPTP)致帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)小鼠模型是目前最经典的帕金森病动物模型之一,可引起小鼠出现静止震颤、肌肉僵直、运动迟缓等许多与PD患者临床表现类似的行为学特征。本文中,我们通过多种行为学实验(横梁实验、强迫游泳实验、爬杆实验、旷场运动、转棒实验)研究并比较了MPTP对野生型小鼠和神经细胞中Nrsf基因敲除(Nrsf cKO)小鼠在PD相关行为学上的影响；利用蛋白质印迹、免疫组化等方法研究了酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)、胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)等的表达变化；利用高效液相色谱法(High Performance LiquidChromatography,HPLC)分析了多巴胺(DA)、3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)、5-羟色胺(5-HT)、5羟基吲哚乙酸(5-HIAA)等神经递质的变化情况。结果显示,与野生型PD模型小鼠相比,Nrsf cKO PD小鼠过横梁的时间有延长趋势、游泳能力下降、爬杆速度缓慢；纹状体中TH蛋白的表达明显下降,表明多巴胺能神经元减少增加,GFAP增多显示黑质星形胶质细胞更加活跃；纹状体中DA及其代谢产物DOPAC明显下降,这些指标表明Nrsf cKO PD小鼠帕金森程度更加严重。
我们的工作首次阐述了NRSF在小鼠PD发生过程中具有重要的功能,在小鼠神经细胞中敲除Nrsf基因后,MPTP导致的多巴胺能神经元损伤更加严重,并可能对单胺类递质代谢酶产生了不同作用,从而影响了小鼠黑质和纹状体区DA、5-HT等抑制性神经递质系统之间的平衡关系,进而影响到多巴胺能神经元对神经毒素MPTP的敏感性,这种作用可能是通过调控TH、5-HT1A等基因的表达实现的。
第三章 HEK293细胞中NRSF/REST调控的靶基因群的鉴定
在建立细胞特异性的基因表达模式中,转录抑制与转录激活同样重要。神经元限制性沉默因子NRSF/REST是一种非常重要的负转录调控因子,通过结合特定的DNA序列神经元限制性沉默元件NRSE/RE1,在非神经细胞、神经前体细胞中抑制许多神经特异性基因的表达。目前,NRSF/REST在神经发育中的功能被广泛研究,但在非神经细胞中具体调控的靶基因还知之甚少。
本文中,我们采用RNA干扰技术联合cDNA芯片技术的策略鉴定非神经细胞系人胚胎肾HEK293细胞中NRSF/RESF调控的靶基因。根据芯片结果,下调HEK293细胞中Nrsf/Rest基因的表达后,发现54个基因的表达上调,其中13个基因被进一步的实时荧光定量PCR证明。我们的结果验证了已有的基于生物信息学、染色质免疫共沉淀联合芯片技术、染色质免疫共沉淀联合高通量测序技术等研究数据的可靠性。而且,尽管已经发现或预测有上千种基因受NRSF/REST调控,我们的数据表明,在特定的细胞类型中,只有少数基因是受NRSF/NRSE(REST/RE1)调控系统直接调控的。