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目的：
研究去双前肢诱导大鼠直立状态对腰椎间盘细胞衰老的影响;建立D-半乳糖诱导小鼠椎间盘细胞衰老模型,研究腰椎间盘细胞衰老的病理机制,并进一步探讨益气化瘀补肾方及有效组分延缓腰椎间盘细胞衰老的作用规律研究;探讨黄芪甲苷、补骨脂素及阿魏酸对诱导大鼠软骨细胞衰老的调控作用。
方法：
1.观察去双前肢诱导大鼠直立状态对腰椎间盘细胞衰老的影响。选择40只1月龄SD大鼠,随机分为5、9月模型组和空白对照组,共4组(每组10只,雌雄各半)。各模型组通过截断大鼠双前肢,放于特制饲养笼内饲养,训练(通过有规律抬高饲养槽和饮水瓶)以诱导其直立;空白对照组不予处理,置于普通饲养笼内饲养。分别在术后5、9月,过度麻醉下取材,取下模型组和对照组腰部椎间盘,进行与细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶染色、免疫组化染色以及Real-time RT-PCR检测与分析。
2.D.半乳糖诱导小鼠腰椎间盘细胞衰老机制及益气化瘀补肾方与拆方作用规律的研究。益气化瘀补肾方与拆方对D-半乳糖诱导小鼠腰椎间盘细胞退变与衰老的影响。8周龄C57BL/6J小鼠110只,随机分为:空白对照组、盐水灌胃组、益气化瘀补肾方灌胃组、益气化瘀方灌胃组、补肾方灌胃组、维生素E灌胃组、皮下注射诱导衰老组、黄芪甲苷组、川芎嗪组、补骨脂素组、单体复合组共十一组(每组10只,均为雄性),18只12月龄雄性C57BL/6J小鼠作为自然衰老对照组。除了空白对照组及自然衰老对照组外,其余各组每日皮下注射D-半乳糖,并分别用益气化瘀补肾方、益气化瘀方、补肾方、维生素E组小鼠给予中药复方和维生素E水溶液每日灌胃,黄芪甲苷、川芎嗪、补骨脂素组及三种单体复合组小鼠进行腹腔注射连续给药10周后,处死相对应的各组小鼠,取下腰部椎间盘,进行HE染色和藏红形态学染色、免疫组化分析以及Real-time RT-PCR检测。
3.H2O2与D-半乳糖诱导C518软骨细胞株衰老及黄芪甲苷、补骨脂素与阿魏酸作用规律的研究。培养大鼠C518软骨细胞株,采用H2O2和D-半乳糖法诱导该细胞株衰老,分别用黄芪甲苷、补骨脂素和阿魏酸干预。MTT法检测细胞活性及观察细胞生长情况,流式细胞术检测细胞周期变化。用与细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶活性染色法检测细胞衰老情况,细胞免疫化学染色检测p16INK4a、p27KIP及p21蛋白表达,Real-time RT-PCR检测相关基因mRNA表达,Western blot技术分析细胞周期相关蛋白。
结果：
1.大鼠直立状态加速椎间盘细胞衰老。模型组椎间盘细胞β-半乳糖苷酶活性染色增加;免疫组化染色发现模型组腰椎间盘软骨终板和纤维环组织p16INK4a和p27KIP明显高表达;Real time-PCR检测发现椎间盘中p16INK4a、RB、PTEN、p27KIP、p19ARF和RAGE mRNA表达显著增加,cyclin D1mRNA表达在术后9月上调并有显著统计学意义,CDK4和TERTmRNA表达显著减少,p21 mRNA表达随月龄增加而减少。
2.益气化瘀补肾方延缓椎间盘细胞衰老。形态学HE、藏红染色显示益气化瘀补肾方、拆方及其有效组分可以不同程度维持椎间盘高度,防止纤维环撕裂和板层紊乱,增加软骨终板非钙化层胶原基质,防止软骨终板变薄;免疫组化染色显示可以明显增加椎间盘髓核细胞外层基质和纤维环中Ⅱ型胶原的蛋白表达,降低软骨终板X型胶原表达;降低软骨终板和纤维环中p16INK4a、p27KIP和RAGE表达;Real-time RT-PCR检测证明益气化瘀补肾方、拆方及其有效组分均可以显著降低p16INK4a、cyclin D1、RB、p19ARF、p53、Mdm2、RAGE、ADAMTS-5、Colloal及MMP13 mRNA表达,增加Bmil、CDK4、TERT、C-myc、Col2α1及Aggrecan mRNA表达。
3.黄芪甲苷、补骨脂素及阿魏酸延缓软骨细胞衰老。黄芪甲苷(12.5-100μM)、补骨脂素(12.5-100μM)及阿魏酸(12.5-100μM)均可逆转H2O2和D-半乳糖诱导软骨细胞C518增殖抑制,并呈剂量依赖性。黄芪甲苷、补骨脂素及阿魏酸都可以降低衰老相关β-半乳糖苷酶活性染色,降低H2O2和D-半乳糖诱导衰老软骨细胞p16INK4a蛋白的表达。黄芪甲苷(50μM)与补骨脂素(25μM)的作用明显,优于阿魏酸(25μM)。黄芪甲苷还可以降低D-半乳糖诱导软骨细胞p27KIP和p21蛋白的表达,抑制p16INK4a、cyclin D1、RB、PTEN、p27KIP、p19ARF、p21和RAGE mRNA过量表达,增加CDK4、TERT mRNA表达,不同剂量黄芪甲苷对C518细胞周期相关蛋白p27KIP影响不大。
结论：
1.去双前肢诱导大鼠直立状态造成腰椎间盘组织受力异常增加,长期异常应力状态导致腰椎间盘组织细胞增殖能力下降,细胞外基质的合成与降解紊乱,加速了腰椎间盘细胞衰老。腰椎间盘细胞衰老与椎间盘退变密切相关。
2.益气化瘀补肾方、拆方及其有效组分均可以延缓D-半乳糖诱导小鼠腰椎间盘细胞衰老和退变,能有效地防治腰椎间盘细胞衰老与退变。D-半乳糖诱导小鼠腰椎间盘细胞衰老是椎间盘退变的根本原因,而椎间盘退变加速了椎间盘细胞衰老。
3.益气化瘀补肾方有效组分黄芪甲苷、补骨脂素及阿魏酸均能逆转对H2O2和D-半乳糖处理的软骨细胞C518的增殖抑制,延缓软骨细胞衰老,且一定剂量的黄芪甲苷的作用最稳定。
4.腰椎间盘细胞衰老与中医的“气血理论”和“肾主骨,生髓”有关。