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番茄是我国的主要果蔬之一，属于呼吸跃变型果实(Climacteric fruits)，成熟后贮藏期短，依靠生物技术改良番茄的耐贮性对农业生产和农产品销售极其重要。多聚半乳糖醛酸酶(PG)是在果实成熟过程中特异表达的细胞壁水解酶，是一种细胞壁结合蛋白，它的主要功能是将果实细胞壁中多聚半乳糖醛酸降解为半乳糖和醛酸，使细胞壁结构解体，导致果实的软化。RNA干扰(简称RNAi)是近几年发展起来的一项使真核生物功能基因表达水平降低或关闭的先进的生物技术，以其特异性、高效性和广泛性的优势，逐渐成为一项极具潜力的基因功能研究技术。
本研究分别克隆了PG基因的cDNA序列和启动子区的DNA序列，设计其RNA干扰序列并克隆到植物双元表达载体中，分别通过花粉管通道法和农杆菌侵染法将构建的RNA干扰植物双元表达载体导入番茄细胞中。以期获得耐贮转基因番茄植株，为进一步市场化奠定坚实的前期研究基础。研究的主要结果概述如下：
根据已发表的番茄PG基因启动子的核苷酸序列设计两对引物，以番茄叶片总DNA为模板，经过PCR扩增得到PG基因全长启动子序列和5’端缺失序列，然后分别克隆到pUC18载体中。序列分析表明PG基因启动子全长序列为1415bp，与已发表序列只有四个碱基的差异，同源率为99％。应用已设计的限制性内切酶酶切位点，将上述两个片段反向连接，形成PG基因启动子的反向重复序列，并克隆到中间载体pBluescript SK+中；序列分析表明3’端互补区段的碱基序列完全一致，在体内转录后可以互补配对结合，形成hpRNA结构。随后，将反向重复序列克隆在植物双元表达载体pPGN中，构建了PG基因启动子区的RNA干扰植物双元表达载体pNPGIR。并将pNPGIR转化LBA4404，建成了植物转化工程农杆菌。
设计两对引物，用RT-PCR的方法获得了番茄PG cDNA全长序列和5’端缺失序列，将全长cDNA序列克隆到pBluescript SK+载体中。测序结果表明PGcDNA全长序列为1569 bp，与已发表的序列只有两个碱基的差异，同源率为99％。应用已设计的限制性内切酶酶切位点，将上述两个片段反向连接，形成PG基因编码区的反向重复序列，将反向重复序列克隆在植物双元表达载体pPGN中，构建了PG基因编码区的RNA干扰植物双元表达载体pNCPG5dLIR。并将pNCPG5dLIR转化LBA4404，建成了植物转化工程农杆菌。
优化番茄5个品种再生体系，其子叶外植体的再生顺序为：BD>T4>MFg，TJ544>polish Lim，以BD子叶外植体再生率最高。以BD子叶为外植体，确立了适宜的分化培养基为MS+6-BA1.0 mg/L+蔗糖3％+琼脂0.6％、适宜的生根培养基为MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.05 mg/L+蔗糖3％+琼脂0.6％、遗传转化中适宜的卡那霉素和头孢霉素的抑菌浓度分别为6.5 mg/L和150 mg/L。
将含pNCPG5dLIR和pNPGIR的根癌农杆菌LBA4404分别转化预培养2天的BD子叶外植体，当农杆菌生长的OD600为0.6～0.8之间时，菌液不作稀释，侵染效果比较好，此时的侵染时间以15 min为宜；共培养2～3天后转至分压培养基上进行筛选。分压培养基的筛选方式为：不定芽分化固体培养基+Kan6.5mg/L Cef100 mg/L→Kan8.0 mg/L Cef100 mg/L→Kan10 mg/L Cef50mg/L→Kan15 mg/L Cef50 mg/L。
利用花粉管通道法介导番茄的遗传转化，收获转基因种子；确立了转基因种子最适的Km筛选浓度50 mg/L。直接种植种子，得到转基因苗后，微量法提取叶片DNA，用PCR的方法对获得的转基因苗进行初步的筛选。对于1号样品转化植株，采用单引物PCR的方法初步获得了5株有阳性结果的苗，已经将苗移至大田中，还需做进一步的鉴定证实。