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FADD(Fas-associated death domain)最早发现在TNFR诱导的细胞凋亡中扮演着不可或缺的角色。FADD缺失的细胞能够抵抗膜受体诱导的细胞凋亡。事实上除了细胞凋亡以外，它还参与了众多的生理过程，包括胸腺发育、淋巴细胞的激活及增殖、心脏发育。进一步的研究发现FADD参与这些过程与其凋亡接头分子的功能无关，这意味着FADD还具有着新的功能。除此之外，FADD还被发现是一种磷酸化蛋白，FADD191Ser磷酸化修饰状态和修饰程度的改变会导致FADD敲除的类似症状，例如胸腺发育受阻、淋巴细胞的激活及增殖抑制。与此同时，FADD191Ser磷酸化修饰却并不影响TNFR介导的细胞凋亡。这一结果不仅为FADD参与众多生理过程与其凋亡功能无关提供了强有力的证据，也同时表明磷酸化在这种新功能的发挥中扮演着重要的角色。 为了研究FADD及其磷酸化的非凋亡功能，我们以FADD敲除小鼠的胚胎成纤维细胞(FADD KO MEFs)，FADD功能缺失的Jurkat细胞，FADD191Ser突变的胚胎成纤维细胞(FADD-D MEFs)及小鼠（FADD-D小鼠）为研究工具，对FADD缺失或磷酸化后的胞内信号通路进行了系统的研究。研究发现FADD敲除或磷酸化后cPKC信号通路发生过度激活，其激活后信号终止机制受损，从而导致了细胞骨架、细胞迁移、细胞周期等生理性过程的改变。在此基础上，我们进一步研究了FADD磷酸化通过PKC调控非受体细胞凋亡及衰老的分子机制。 首先，我们发现FADD敲除以后的MEFs细胞中ERK磷酸化是上调的。通过对其上游信号进行追溯，发现:FADD敲除以后，胞内内源性的PKCα和PKCδ的蛋白水平是上调的。在排除了转录水平的影响以后，我们推测PKCα和PKCδ的降解受阻导致了蛋白水平的上调。在此基础上，我们利用PKC激活后会发生降解的模型对FADD KO MEFs中的PKC进行了研究，发现PKC激活后只有PKCα的降解受到了明显的阻滞，而PKCδ仅受到了轻微的阻滞。这一结果显示，不论是静息还是激活状态，FADD敲除都会导致PKCα蛋白水平的积累。PKC是一种磷酸化蛋白，磷酸化对其活性、稳定性有着重要的调节作用。为了进一步研究FADD参与PKCα降解调控的具体机制，我们检测了FADD KO MEFs中上调状态下PKC的修饰状态。结果显示，FADD KO MEFs中PKC是高度磷酸化的。与此对应，PKC及其下游通路分子的活性也是上调的。这些结果表明FADD是通过对PKC去磷酸化的调控而影响了PKCα的降解。进一步的实验验证了FADD KO MEFs中丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性没有改变，因此我们推测PKCα与其磷酸酶PP2A的结合受到了抑制。实验结果也证实了这个推测，FADD KO MEFs中与PKCα结合的PP2A催化亚基(PP2Ac)明显低于正常的MEFs细胞。这一结果表明FADD扮演了一个新的接头分子的功能，介导了PKCα和PP2Ac的结合。FADD的缺失导致了PKCα的去磷酸化过程受阻，引发了蛋白水平、磷酸化及活性的上调。为了进一步验证FADD的这一新接头分子功能，我们检测了FADD-D MEFs细胞中PKCα的蛋白水平、磷酸化和活性。发现结果与FADD KOMEFs类似，三者都发生了上调。这一结果在FADD-D小鼠的心脏和骨骼肌中都得到了重复。在FADD-D小鼠的心脏和肌肉中，PKC与PP2A的结合都受到了抑制。这一结果表明FADD的磷酸化导致其丧失介导PKC与PP2A结合的功能。在验证了FADD与PP2Ac的结合之后，我们发现磷酸化使其失去了与PP2Ac结合的能力。这一结果表明PP2A是FADD磷酸化调控其非凋亡功能的一个重要的新靶点。 在对FADD的研究过程中我们还发现FADD KO MEFs细胞的异常形态。鉴于PKC在细胞形状、骨架重组及迁移中的重要功能，我们对FADD KO MEFs细胞骨架进行染色发现其细胞骨架的压力纤维明显多于正常细胞。利用PMA诱导细胞骨架重组发现，FADD KO MEFs的骨架重组速度明显快于正常细胞。迁移实验的结果显示，FADD敲除以后的MEFs细胞迁移速度明显加快。这些现象与PKC活性上调所引发的现象高度相似。我们进而利用cPKC及其下游分子ERK的特异性抑制剂发现，cPKC的抑制能够有效逆转FADD KO MEFs中骨架重组和迁移速度的上调。为了进一步验证FADD对细胞骨架的调控作用，我们对FADD-D MEFs的细胞骨架形态、重组及细胞迁移进行了检测，发现结果与FADD KO MEFs类似。这些结果表明FADD及其磷酸化在细胞形状、细胞骨架形态、重组及细胞迁移中扮演了重要的调控性角色。 为了进一步验证FADD对PKC的调控，我们利用FADD缺失的Jurkat细胞对FADD这一新功能在淋巴细胞中的意义进行了研究。与FADD缺失的MEFs细胞结果类似，FADD缺失的Jurkat细胞中PKC的活性发生了上调。FADD缺失能够导致淋巴细胞周期紊乱，细胞周期蛋白p21及cyclin A表达量上调。利用cPKC的抑制剂发现，cPKC的抑制能够有效地恢复FADD缺失引起的Jurkat细胞周期紊乱并且下调p21及cyclin A的蛋白水平。这些结果表明，FADD通过调控PKC的活性在细胞周期中扮演着重要的角色。 FADD磷酸化已被证明在膜受体诱导的细胞凋亡中作用未发生改变，然而我们的实验发现其在过氧化氢诱导的线粒体凋亡通路中扮演着重要的角色。FADD磷酸化能够促进过氧化氢诱导的ROS上调，线粒体损伤及细胞凋亡的发生。PKC对过氧化氢诱导的ROS上调有着重要的调控作用。因而我们推测FADD磷酸化参与线粒体凋亡是通过PKC介导的。cPKC的特异性抑制剂能够有效抑制FADD-D MEFs中ROS的上调，和线粒体损伤的发生。这表明FADD磷酸化通过PKC调控细胞内源性的ROS的产生及线粒体的完整性。为了进一步验证这一调控的生理意义，我们选取FADD-D小鼠中的心脏和骨骼肌进行检测，这些组织中cPKC磷酸化发生上调，发现其线粒体发生了严重的破损。我们进一步检测了这两个组织中ROS的水平。结果发现在骨骼肌中ROS发生了明显的上调。在心肌中也有上调。为了研究cPKC在心脏和肌肉衰老中的变化，我们检测了衰老小鼠心脏和肌肉中cPKC的磷酸化和活性。结果发现，随着衰老的发生，cPKC的磷酸化和活性是上调的。为了进一步验证PKC的活性上调，我们检测了cPKC的其中一种底物p66Shc的磷酸化。p66Shc是调控内源性ROS产生的核心性分子，在被PKCβ磷酸化以后它转移到线粒体上诱导ROS的产生。它的磷酸化被证明是随着衰老而上调的。结果显示在FADD-D小鼠心脏和骨骼肌中的p66Shc的磷酸化都是上调的。鉴于p66Shc已是公认的衰老基因，我们对FADD-D小鼠进行的观察发现，这类小鼠在10个月时出现了脱毛、皮肤皱缩、行动迟缓等明显的衰老症状，这些症状都与p66Shc磷酸化上调相符。这一结果表明FADD磷酸化通过对动物内源性ROS产生的调控而促进衰老的发生。